梁小慶，閆鵬飛，劉 煜*

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京 210009；2中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)屬于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族，是一種有效的促進(jìn)血管形成和增加血管通透性的誘導(dǎo)因子。PIGF最早從胎盤cDNA文庫中分離得到，通常在滋養(yǎng)層、正常甲狀腺以及在傷口愈合期間進(jìn)行表達(dá)。它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化及存活，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的老化和凋亡。PIGF在胃癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和中耳膽脂瘤中明顯上升，可以作為這幾種腫瘤的指標(biāo)性物質(zhì)，說明PIGF和部分腫瘤血管生成有著密切的關(guān)系。近年來，國內(nèi)外對(duì)于PIGF在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞功能、加快缺血性疾病進(jìn)程及促進(jìn)腫瘤生長等方面進(jìn)行了大量研究。PIGF是一種分泌性同二聚體糖蛋白，其基因定位于14q24-q31。根據(jù)編碼基因RNA不同的剪接方式，目前有4種異構(gòu)體：PIGF-1、PIGF-2、PIGF-3、PIGF-4，其中以PIGF-2在人體中表達(dá)最為豐富，活性最強(qiáng)，因此本研究采用畢赤酵母表達(dá)重組人PIGF-2蛋白，用于后續(xù)的抗體制備及活性研究。在制備中，由于PIGF蛋白具有肝素親和活性，因此采用Heparin-Sepharose CL6B肝素親和色譜進(jìn)行高效的分離純化。

1 材 料

1.1 質(zhì)粒、菌株和試劑

Taq酶、dNTP(中國上海翊圣生物科技有限公司)；T4 DNA連接酶、EcoR I、NotI、PMD-19T、SalI(日本Takara公司)；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Lyticase(中國天根生化科技有限公司)；heparin-Sepharose CL4B(美國GE公司)；G418[生工生物工程上海(股份)有限公司]；無氨基酵母氮源(YNB，美國Difico公司)；生物素(美國Amresco公司)；PIGF抗體(美國Santa Cruzs公司)；胰蛋白胨、酵母粉(英國Oxoid公司)；人PIGF-2 cDNA (中國北京義翹神州生物技術(shù)公司)；pPIC9K、GS115、E.coliDH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 儀 器

電轉(zhuǎn)儀、PCR儀、酶聯(lián)免疫分析儀、蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(上海天能公司)；瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)；蛋白核酸檢測(cè)儀(南京大學(xué)儀器廠)；數(shù)顯橫流泵(上海滬西儀器公司)。

2 方 法

2.1 PIGF-2基因的TA克隆

采用Primer 5設(shè)計(jì)一對(duì)PIGF-2基因的特異性引物:PI5：5′-CGGAATTCATGCCGGTCATGAGGCTGTTC-3′和PI3：5′-AAATATGCGGCCGCTTACCTCCGGGGAACAG-3′,以購得的人PIGF-2 cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,切膠回收與預(yù)期大小一致的條帶,通過T-A克隆將其連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布在LB平板(含氨芐青霉素)上,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h,經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2 構(gòu)建pPIC9K-PIGF-2質(zhì)粒

將目的片段和pPIC9K質(zhì)粒分別用EcoR I和NotI酶切，37 ℃過夜酶切，經(jīng)割膠回收，T4 DNA 連接酶連接8 h，轉(zhuǎn)入DH5a中，挑取陽性克隆酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證結(jié)果正確的菌株送去測(cè)序。

2.3 電轉(zhuǎn)化pPIC9K-PIGF-2

將測(cè)序正確的菌株接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以SalI酶切線性化，1.2%瓊脂糖電泳割膠回收，-20 ℃保存。設(shè)定電轉(zhuǎn)儀參數(shù)(電壓1 500 V，時(shí)間4 ms)，將SalI線性化的重組質(zhì)粒10 μL加入制備好的酵母細(xì)胞GS115 100 μL中，混勻，轉(zhuǎn)入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯內(nèi)，置電轉(zhuǎn)儀，電擊后取出，迅速放回冰上加入預(yù)冷山梨醇1 mL，混勻，吸取200 μL涂布于MD平板上。30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取陽性克隆。

2.4 陽性克隆的篩選

將MD平板上長出的單菌落依次接種于濃度遞增的G418-YPD平板上(G418質(zhì)量濃度為0.25，0.5，2.0，4.0 mg/mL)，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取多拷貝陽性克隆，采用Lyticase酶解及PCR法鑒定陽性克隆。

2.5 陽性克隆的誘導(dǎo)表達(dá)

隨機(jī)挑選陽性克隆，依次接種于YPD培養(yǎng)液5 mL和BMGY培養(yǎng)基10 mL中，30 ℃分別培養(yǎng)過夜。第3天室溫下4 000 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀重懸于BMMY培養(yǎng)液25 mL中，加入甲醇濃度為0.5%，30 ℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)7 d固定時(shí)間補(bǔ)加甲醇，第7天，8 000 r/min離心10 min，收獲上清液。取上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳和ELISA鑒定。

2.6 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.6.1 甲醇誘導(dǎo)濃度的選擇 取50 mL滅菌錐形瓶6只，按上述方法接種等量的菌液，每天按以下濃度補(bǔ)加甲醇：0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%，2.0%，培養(yǎng)7 d收集培養(yǎng)基，采用ELISA法測(cè)定不同誘導(dǎo)濃度下目的蛋白的表達(dá)量。

2.6.2 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 取500 mL錐形瓶1只，接種菌液，每日按1%補(bǔ)加甲醇溶液，分別于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1，2，3，4，5，6，7 d取培養(yǎng)液1 mL留樣，采用ELISA法分別測(cè)定不同時(shí)間目的蛋白的表達(dá)量。

2.7 重組蛋白的分離純化及鑒定

酵母培養(yǎng)液8 000 r/min離心15 min，分離菌體，培養(yǎng)上清液在平衡液20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中透析平衡過夜后，過0.45 μm濾膜后上樣于Heparin-Sepharose CL6B親和柱，用平衡液和含1 mol/L NaCl的平衡液進(jìn)行0～1 mol/L線性梯度洗脫，收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE和ELISA檢測(cè)。

2.8 ELISA檢測(cè)

包被酶標(biāo)板，其中加入100 μL rhPIGF-2酵母發(fā)酵液或者純化后重組人PIGF-2樣品(1 μg/mL)和100 μL包被緩沖液，4 ℃過夜。PBST洗滌后，加入封閉液(3%BSA-PBST),37 ℃ 2 h。加入一抗(將抗體以1%BSA溶液稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h后，加入HRP標(biāo)記的抗鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h后顯色。采用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定樣品吸收度。

3 結(jié) 果

3.1 PIGF-2基因的PCR結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到PIGF-2基因，經(jīng)瓊脂糖電泳顯示，條帶位置在500 bp左右，與理論預(yù)期大小相符(圖1)。

Figure1 Detection of the amplification product of human placental growth factor 2 (PIGF-2) gene by PCR

3.2 載體構(gòu)建圖

PIGF基因經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后條帶位置正確，測(cè)序檢查證明PIGF基因已成功重組于載體的多克隆位點(diǎn)，載體構(gòu)建成功(圖2)。

3.3 轉(zhuǎn)化克隆的PCR檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化克隆均有500 bp的陽性條帶。PCR方法檢測(cè)Mut+/Muts結(jié)果見圖3。由圖3可知，用AOX1引物(5AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′3AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)進(jìn)行PCR，1、2、3、5、6、7、8號(hào)菌株均產(chǎn)生了1 000 bp左右和2 000 bp左右兩條帶，此為Mut+型菌株，而4號(hào)菌株在2 000 bp沒有條帶，即為Muts型菌株。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇為碳源，在MM平板上正常生長，而因外源基因的插入發(fā)生交換導(dǎo)致AOX1基因缺失的Muts卻不能在MM平板上正常生長，雖然存在與AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作為碳源的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AOX1。

Figure2 Map of recombinant pPIC9K-PIGF-2

Figure3 Detection of recombinant plasmid pPIC9K-PIGF-2 Line 1- 8：Sample 1- 8；Line 9：Marker

3.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

3.4.1 甲醇濃度的影響 由圖4可見，甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高。

Figure4 Influence of concentration of methanol on the expression of PIGF-2 inPichiapastoris

3.4.2 誘導(dǎo)時(shí)間的影響 由圖5可見，誘導(dǎo)后7 d內(nèi)表達(dá)量不斷增加，所以將誘導(dǎo)時(shí)間定為7 d。

Figure5Influence of the induction period on the expression of human PIGF-2 inPichiapastoris

3.5 重組蛋白的純化鑒定結(jié)果

由圖6和圖7可見，親和色譜只有一個(gè)洗脫峰，由相對(duì)分子質(zhì)量大小及Western blot結(jié)果可知，該洗脫峰為目的蛋白峰，其穩(wěn)定態(tài)為二聚體，并且有少量單體存在。

Figure6 Elution curve of recombinant human PIGF-2

Figure7 SDS-PAGE and Western blot of recombinant human PIGF-2 expressed inPichiapastoris

A:Reduced;B:Non-reduced

4 討 論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核細(xì)胞的易操作性，也有真核細(xì)胞翻譯后的加工能力，是重組糖蛋白比較理想的表達(dá)體系。pPIC9K載體全長9 276 bp，含有一個(gè)ColE1復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗性基因(Amp、Kan)，它是一個(gè)穿梭載體，既可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞中表達(dá)，且有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1，能在甲醇的誘導(dǎo)下高效表達(dá)外源蛋白。所用表達(dá)菌株為GS115畢赤酵母，具有組氨酸脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體pPIC9K而使其具有His+表型以篩選陽性轉(zhuǎn)化子，因此可在組氨酸缺陷的MD平板上篩選。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇為碳源，在MM平板上正常生長，而因外源基因的插入發(fā)生交換導(dǎo)致AOX1基因缺失的Muts卻不能在MM平板上正常生長，雖然存在與AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作為碳源的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AOX1。在篩選Mut+基因型菌株時(shí)，曾按照文獻(xiàn)方法，從高濃度G418平板上挑取高拷貝菌株于MM和MD平板上，再觀測(cè)其在平板上的生長情況，挑選在兩種板子上生長一樣快的為Mut+基因型。但實(shí)際情況是在挑取菌落過程中，用牙簽很難把握挑取的菌量，這就很難判斷菌在MM和MD平板上生長情況。因此本研究通過AOX1引物鑒定酵母染色體的基因組，由于Mut+基因型中外源重組子是通過單交換以插入的方式整合到酵母染色體中的，PCR結(jié)果應(yīng)該出現(xiàn)酵母自身的AOX1基因條帶，以及插入片段中AOX1一部分序列所產(chǎn)生的條帶。而Muts型基因型外源基因是通過雙交換的方式替換掉酵母基因組自身的AOX1基因，結(jié)果應(yīng)該只出現(xiàn)插入片段PCR所產(chǎn)生的一條條帶，鑒于此特征可以篩選Mut+基因型菌株。

SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)的PIGF蛋白大部分以二聚體形式存在，少量以單體形式存在。所有陽性酵母菌株的蛋白產(chǎn)量都很低，探究其原因，可能是由于稀有密碼子過多。如果要大量表達(dá)蛋白則需要改造基因，使其更適合酵母體系表達(dá)。

參 考 文 獻(xiàn)

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