劉志平，岳夢琳

(平頂山學院醫(yī)學院， 河南 平頂山 467000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。侵襲是腫瘤的十大特征之一，也是導致乳腺癌患者不良預后甚至死亡的重要原因之一[2]。金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP-2)通路在腫瘤的侵襲中具有極其重要的作用[3]，TIMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)的抑制物，而MMP2和MMP9能夠降解幾乎所有類型的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進腫瘤的侵襲[4]。大量研究已經(jīng)證實，通過降低腫瘤細胞內(nèi)MMP2和MMP9的表達，可以抑制腫瘤細胞侵襲能力[5]。在多種腫瘤包括乳腺癌中，TIMP-2呈低表達[6]，而具體機制尚不明確。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長度約22～24 nt的非編碼小分子RNA，在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，近年來的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-106a(microRNA-106a)與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。因此，本研究將探討microRNA-106a是否通過調(diào)節(jié)TIMP-2通路，促進乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲，旨在為乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco；脂質(zhì)體Lipofectamine?3000、TRIzol試劑和RNA提取試劑盒均購自Invitrogen；microRNA序列和qPCR引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo;兔抗人TIMP-2多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自Santa Cruz；兔抗人MMP2多克隆抗體和兔抗人MMP9多克隆抗體均購自CST；HRP標記的羊抗兔 II 抗購自上海英基生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購自Millipore；Matrigel購自上海前塵生物科技有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱(BB15，Thermo)；超微量核酸蛋白測定儀(ND2000，Thermo)；定量PCR擴增儀(ABI 7500，ABI)；凝膠成像儀(GelDoc-It，UVP)；顯微鏡(BX61，Olympus)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng)，取復蘇后第4～10代的細胞進行實驗。

取4×105個處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000將microRNA-106a抑制物(microRNA-106a inhibitor)、microRNA-106a 模擬物(microRNA-106a mimic)及microRNA無關(guān)序列(即陰性對照組,negative control組)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中，操作步驟參照試劑說明書。取未轉(zhuǎn)染細胞為空白對照組(control組)。

2.2qPCR實驗檢測轉(zhuǎn)染效率 收集1×105細胞，各細胞樣品中加入1 mL TRIzol試劑，抽提細胞總RNA，按照RNA提取試劑盒的說明書操作。超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。MMP2、MMP9、TIMP-2、GAPDH、microRNA-106a及內(nèi)參照U6的引物序列見表1。定量PCR擴增儀檢測microRNA-106a表達水平。qPCR擴增體系為10 μL，反應(yīng)條件為: 50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-106a相對表達量，實驗重復3次后，進行統(tǒng)計分析。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

2.3Western blot實驗檢測蛋白表達水平 收集(2～5)×105個細胞，加入RIPA蛋白裂解液，抽提細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，加入兔抗人TIMP2多克隆抗體(1∶2 000稀釋)、兔抗人MMP2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔 II 抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度比值。實驗重復3次后，進行統(tǒng)計分析。

2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 g/L Matrigel 50 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，使Matrigel凝固；在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，Transwell小室中加入150 μL的細胞懸液(細胞總數(shù)約1×105個)；48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細胞，將Transwell小室置于0.1%結(jié)晶紫溶液中，室溫染色5 min，去離子水中洗滌后，顯微鏡下觀察，每孔隨機選取3個視野拍照(×400)，并記錄每個視野的細胞數(shù)目。實驗重復3次后，進行統(tǒng)計分析。

2.5螢光素酶報告基因?qū)嶒?luciferase reporter assay)檢測基因表達情況 PCR擴增克隆人TIMP-2基因3’非翻譯區(qū)(3’ untranslated region，3’-UTR)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI和KpnI酶切后，插入pGL3-Basic螢光素酶報告基因載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定，構(gòu)建含有TIMP-2基因3’-UTR的報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT，同時構(gòu)建含有突變TIMP-2基因3’-UTR的報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut。

MDA-MB-231細胞接種于24孔板中，融合度在70%～80%時，脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor(或microRNA-106a mimic)，報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT(或pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut或pGL3-Basic空載體)以及pRL-SV40海腎螢光素酶表達載體內(nèi)參照質(zhì)粒；每組設(shè)3個復孔，重復3次。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測，操作步驟如下：棄去培養(yǎng)液，預冷PBS洗滌細胞3次，每孔加入100 μL PLB裂解液，-80 ℃冰箱裂解1 h，收集細胞裂解液，離心，取上清。EP管中加入10 μL上清，再加入50 μL LAR II，檢測螢火蟲螢光素酶活性；隨后加入50 μL Stop & Glo試劑，檢測內(nèi)參照海腎螢光素酶的活性，兩者的比值即為pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT、pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut和pGL3-Basic空載體的相對螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩處理效應(yīng)組間比較采用t檢驗，多處理效應(yīng)組間比較采用單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 MicroRNA-106a inhibitor及microRNA-106a mimic的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor 48 h后，細胞內(nèi)的microRNA-106a表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細胞內(nèi)的microRNA-106a表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression levels of microRNA-106a in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)microRNA-106a表達水平

2 MicroRNA-106a對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力的促進作用

為研究microRNA-106a對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲影響，在MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor/mimic，隨后采用Transwell體外侵襲實驗檢測了MDA-MB-231細胞侵襲能力的變化情況。經(jīng)單因素方差分析顯示，4組整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.286，P=0.001)。MicroRNA-106a inhibitor組的侵襲細胞數(shù)目低于陰性對照組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，microRNA-106a mimic組的侵襲細胞數(shù)目高于陰性對照組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The effect of microRNA-106a on the invasion ability of breast cancer MDA-MB-231cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05 control group.

圖2MicroRNA-106a對乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

3 MicroRNA-106a對TIMP-2通路的影響

qPCR實驗結(jié)果顯示，3組中TIMP-2、MMP2及MMP9的mRNA相對表達量整體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MDA-MB-231細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細胞內(nèi)MMP2和MMP9的mRNA相對表達量高于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性；細胞內(nèi)TIMP-2的mRNA相對表達量低于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3A。

Western blot實驗結(jié)果見圖3B。單因素方差分析顯示，3組TIMP-2、MMP2及MMP9 的蛋白相對表達量整體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MDA-MB-231細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細胞內(nèi)MMP2和MMP9蛋白相對表達量顯著高于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性；細胞內(nèi)TIMP-2蛋白相對表達量顯著低于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性。

4 螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測microRNA-106a對 TIMP-2通路的調(diào)控作用

實驗結(jié)果見圖4。3組實驗結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示，整體差異顯著(F=265.931，P=0.000)。MicroRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對螢光素酶活性高于microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic空載體對照組和microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05)；microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對螢光素酶活性低于microRNA-106a mimic+pGL3-Basic空載體對照組和microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05)。

討 論

乳腺癌是女性健康的第一殺手，隨著不斷更新的綜合治療方案的出現(xiàn)，乳腺癌患者的治療效率得到了很大的提高，然而，侵襲與復發(fā)是導致乳腺癌患者不良預后甚至死亡的重要原因之一。探尋導致乳腺癌發(fā)生侵襲的內(nèi)在機制，尋找能夠預測甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤侵襲的靶標，是臨床上亟待解決的問題[8]。

近年來，microRNA調(diào)控基因表達的功能受到廣泛的關(guān)注，有研究表明，microRNA能夠調(diào)控大約60%的蛋白編碼基因[9]。microRNA是由Drosha酶和Dicer酶剪切microRNA前體而來，它能夠通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平，降低靶基因的表達水平，導致疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。Calin等[11]在2002年首次提出了microRNA與腫瘤相關(guān)，證實microRNA-15a和microRNA-16-1缺失能夠促進腫瘤的發(fā)生。目前，愈來愈多的研究證實，microRNA在腫瘤中發(fā)揮著類似抑癌基因或癌基因的作用[12-13]。在各種腫瘤組織中，microRNA-106a的異常表達與腫瘤細胞包括乳腺癌細胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，Xiao等[14]在胃癌中的研究表明，microRNA-106a的高表達與腫瘤的分期、分化、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Chen等[15]研究證實，microRNA-106a能夠促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲；而Shin等[7]的研究則表明，在膀胱癌細胞中，microRNA-106a能夠通過調(diào)節(jié)MAPK通路，抑制細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。本研究則分析microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲過程中的作用，并對其內(nèi)在機制進行初步探討。

Figure 3. The effects of microRNA-106a on the expression of TIMP-2, MMP2 and MMP9 at mRNA (A) and protein (B) levels in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsnegative control group.

圖3MicroRNA-106a對乳腺癌MDA-MB-231細胞中TIMP-2、MMP2以及MMP9的mRNA和蛋白表達的影響

Figure 4. The regulatory role of microRNA-106a in the TIMP-2 pathway investigated by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGL3-Basic empty vector group;#P<0.05vspGL3-Basic-TIMP-2-3’UTR WT group.

圖4螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測microRNA-106a對TIMP-2通路的調(diào)控作用

我們首先在乳腺癌MDA-MB-231細胞中分別轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic，48 h后細胞內(nèi)的microRNA-106a水平分別顯著地降低和升高。采用Transwell體外侵襲實驗探究microRNA-106a與乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)microRNA-106a能夠顯著增強MDA-MB-231細胞的侵襲能力。ECM是腫瘤侵襲過程中必須突破的障礙，MMP2和MMP9能夠降解ECM，促進腫瘤的侵襲，而TIMP-2是MMP2和MMP9的天然抑制劑，TIMP-2增加，將抑制腫瘤的侵襲[16]。在探討microRNA-106a促進乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲的機制研究中，本研究重點關(guān)注了TIMP-2信號通路。上調(diào)microRNA-106a表達水平后發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細胞內(nèi)的TIMP-2的 mRNA與蛋白表達水平顯著降低，而其抑制底物MMP2和MMP9的mRNA與蛋白表達水平顯著增加。采用螢光素酶報告基因試驗來研究microRNA-106a是否能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic對報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性有顯著影響，即microRNA-106a inhibitor能夠增強pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，而microRNA-106a mi-mic則降低了pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，證實microRNA-106a能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達。本研究證實，在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，microRNA-106a表達增加后，細胞的侵襲能力顯著增強，并且高表達的microRNA-106a能夠降低MDA-MB-231細胞內(nèi)TIMP-2的表達，增加MMP2和MMP9的表達；螢光素酶報告基因試驗證實，microRNA-106a 能夠直接負調(diào)控TIMP-2的表達。已有研究證實，microRNA-106a通過調(diào)控TIMP-2基因表達，促進膠質(zhì)瘤干細胞[17]、胰腺癌[18]和胃癌[19]等腫瘤細胞的侵襲遷移。本研究并未對其它與細胞侵襲相關(guān)的信號通路和基因進行探討，在后期研究中，將對microRNA-106a促進乳腺癌細胞侵襲的其它可能機制，進行深入研究。

綜上所述，乳腺癌MDA-MB-231細胞中，高表達的microRNA-106a能夠通過下調(diào)TIMP-2通路，促進細胞體外侵襲能力。microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲中發(fā)揮著重要作用。

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