傅潤熹，楊若松，黃雪琴，何文明，余莜燕，韋登明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系， 浙江 寧波 315211)

甲狀腺功能亢進性心臟病(hyperthyroid heart disease，HHD)是由于過量分泌的甲狀腺素對心臟產(chǎn)生直接或間接毒性而引起的心臟疾病，心肌肥大和心律失常是其主要臨床表現(xiàn)[1-2]。細胞內(nèi) Ca2+平衡對維持正常心律起到關(guān)鍵作用，目前發(fā)現(xiàn)心臟中主要有兩大類Ca2+通道，一類是高電壓激活的L型Ca2+通道，另一類是低電壓激活的T型Ca2+通道。T 型鈣通道分為Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3，其閾值為-70～-60 mV[3]，在起搏細胞去極化和自律性中起到了關(guān)鍵的作用。T 型鈣通道在胚胎期廣泛分布于心臟各部位，成年后只在傳導(dǎo)細胞中表達，心室肌中表達很少，但在病理狀態(tài)下，例如急性心肌梗塞、升主動脈縮窄、嚴重缺氧和充血性心力衰竭狀況下發(fā)現(xiàn)在心室肌中T型鈣通道重新表達[4-6]。目前國內(nèi)外尚未見HHD所致心律失常是否與心室肌細胞T型鈣通道表達變化有關(guān)的研究報道。本研究在建立HHD大鼠模型基礎(chǔ)上，檢測心電圖和心肌細胞T型鈣通道Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的表達變化，旨在探討T型鈣通道表達變化與HHD心律失常發(fā)生的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

健康清潔級SD大鼠20只由寧波大學(xué)實驗動物中心代購于浙江省動物中心，合格證號No.0102016，體重(200±10) g，雄性。按隨機數(shù)字表法分為正常對照(normal control)組和HHD組，每組10只。兔抗鼠Cav3.1和Cav3.2多克隆抗體(上海生物工程股份有限公司)；兔抗鼠Cav3.3多克隆抗體(Abbkine)；L-甲狀腺素粉劑和羧甲基纖維素鈉(Sigma)；山羊抗兔 II 抗(中杉金橋有限公司)；RNAfixer常溫?zé)o液氮RNA樣品儲存液和高純總RNA快速提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)；兔抗鼠Cav3.1和Cav3.2抗體(Absin)；抗β-actin抗體(Bioss)。BM-Ⅶ包埋機(宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(LEICA)；CX40生物顯微鏡(Olympus)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達科技發(fā)展有限公司)；Centrifuge 5810R臺式超高速低溫離心機(Eppendorf)；DYY-11B型三恒電泳儀(北京六一儀器廠)；Molecular Image Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；RM6240生物信號采集系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1動物模型的建立 參照文獻方法[7-8]并進行改良，L-甲狀腺素(0.1 g/L)混懸于5 g /L羧甲基纖維素鈉,置于冰箱保存待用，使用前充分搖勻。甲亢性心臟病組大鼠每天腹腔注射L-甲狀腺素0.5 mg/kg，連續(xù)35 d，對照組腹腔注射等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。所有大鼠均飼常規(guī)固體飼料及瓶裝飲用水。

2.2標本采集與制取 L-甲狀腺素給藥35 d后，成功制備甲亢性心臟病大鼠模型，大鼠麻醉后開胸抽取心血5 mL，切取心臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，稱重。冠狀面切取心臟，每只大鼠的左、右心房及左、右心室各切取組織3塊，分別置于10%福爾馬林中固定、-80 ℃冰箱及RNA保存液中保存。脫水浸蠟包埋后制成石蠟切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色，-80 ℃保存的心肌組織用于Western blot檢測蛋白，RNA保存液的心肌組織取材塊用于RT-PCR檢測mRNA。

2.3心電圖檢測 采用RM6240生物信號采集系統(tǒng)，10%水合氯醛麻醉大鼠，分別于右前肢、右后肢及左后肢皮下插入測量電極測量心電圖，HHD組大鼠分別于動物模型造模前及連續(xù)腹腔注射L-甲狀腺素35 d后2次測量心電圖；正常組大鼠相同時間同樣方法分別2次測量心電圖。

2.4血清T3和T4含量的檢測 提取血清5 mL，采用放射免疫分析法測定血清中T3和T4的含量，實驗方法嚴格按照說明書操作。

2.5各組大鼠心臟指數(shù)檢測 實驗第1天，稱取各組大鼠體重；實驗第35天，稱取各組大鼠體重和心臟質(zhì)量。心臟指數(shù)(mg/g)=心臟重量/體重。

2.6左心室心肌細胞橫徑(left ventricular transdia-meter,LVTDM)測定 石蠟切片常規(guī)脫蠟，HE染色，400倍光鏡下觀察心肌細胞形態(tài)變化，選取邊界清楚的心肌細胞，通過細胞核水平測量最短橫徑。每張切片選取5個視野，每個視野選取10個細胞，取平均值作為該動物的心肌細胞橫徑。

2.7免疫組化檢測Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟，經(jīng)3% H2O2室溫孵育，0.01 mol/L枸櫞酸溶液高溫抗原修復(fù)，加入抗Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3抗體免疫組化染色，蘇木素復(fù)染脫水透明封片。Cav3.1和Cav3.3陽性細胞顯示細胞漿出現(xiàn)棕黃色，Cav3.2陽性細胞顯示細胞核出現(xiàn)棕色。400倍光鏡下，每張切片隨機選取5個視野檢測，分別計算積分吸光度(IA)作為Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的陽性表達水平。

2.8Western blot檢測Cav3.1和Cav3.2蛋白的表達 采用Western blot法測量Cav3.1和Cav3.2蛋白表達，以β-actin作為內(nèi)參照。加適量RIPA裂解液冰上放置30 min，12 000×g、4 ℃離心35 min，提取心肌組織總蛋白。取5～10 μL上清液BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線。每孔上樣25 μg總蛋白，6% SDS-PAGE分離蛋白。100 V冰盒中濕轉(zhuǎn)2 h轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上。5% BSA封閉液室溫搖床封閉1 h，加入I 抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，加入HRP標記的II 抗(1∶2 000)室溫搖床孵育1 h，ECL顯色60 s，曝光。

2.9RT-PCR檢測Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的mRNA表達 采用RT-PCR法測量Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的mRNA表達，以GAPDH作為內(nèi)參照。常規(guī)TRIzol法提取總RNA，根據(jù)Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR擴增檢測。PCR反應(yīng)體系：2×Power Taq PCR MasterMix 6 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水15 μL補足至25 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min，進入PCR循環(huán)為94 ℃變性30 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃退火7 min。以樣品條帶的IA與相應(yīng)GAPDH條帶IA的比值作為mRNA的豐度。

表1 RT-PCR引物序列Table 1. The sequences of the primens for RT-PCR amplification

F: forward; R: reverse.

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清T3、T4值

與正常對照組相比較，甲亢性心臟病大鼠血清T3和T4含量明顯高于正常對照組(P<0.01),見表2。

表2各組大鼠血清T3和T4含量、心臟指數(shù)及左心室心肌細胞橫徑的比較
Table 2. The serum contents of T3 and T4, the heart-to-body weight ratio and the transdiameter of left ventricular myocardial cells (LVTDM) (Mean±SD.n=10)

GroupT3 (nmol/L)T4 (nmol/L)Heart/body weight ratio (mg/g)LVTDM (μm)Normal control0.82±0.29157.06±32.553.96±0.3311.56±1.52HHD1.43±0.33??206.71±16.03??5.36±0.93?18.35±1.98??

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group.

2 各組大鼠心電圖檢查結(jié)果

正常對照組大鼠分別于動物模型造模前、后檢測心電圖結(jié)果均正常；HHD組動物模型造模前心電圖檢測結(jié)果均正常，連續(xù)腹腔注射L-甲狀腺素35 d后II導(dǎo)聯(lián)測量心電圖結(jié)果顯示，10例大鼠均出現(xiàn)心電圖異常,其中，心房撲動9例(90%)，心動過速8例(80%)，房室、室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯5例(50%)，部分大鼠同時出現(xiàn)2種及以上的心律失常,見圖1。

3 各組大鼠心臟指數(shù)

實驗第1天，稱取各組大鼠體重，連續(xù)腹腔注射L-甲狀腺素35 d后，發(fā)現(xiàn)HHD組大鼠體重有所下降，而正常組大鼠體重沒有明顯變化。與正常對照組相比較，HHD組大鼠心臟指數(shù)明顯增高(P<0.05)，表明HHD組大鼠心肌明顯肥大,見表2。

4 各組大鼠左心室心肌細胞橫徑的比較

顯微鏡下觀察，正常對照組心肌細胞結(jié)構(gòu)正常;與正常對照組相比較，HHD組大鼠左、右心室的心肌細胞體積增大，心肌細胞橫徑明顯增加(P<0.01)，表明HHD組大鼠心肌細胞明顯肥大，見圖2、表2。

Figure 1. The ECG of hyperthyroid cardiopathy group. A: normal ECG; B: atrial flutter; C: sychnosphygmia; D: I degree atrioventricular block, intraventricular block and atrial electrical wandering.

圖1正常組和甲亢組大鼠心電圖

Figure 2. The observation of myocardial tissue slices with HE staining (×400).

圖2HE染色觀察心肌組織切片

5 免疫組化測定各組大鼠心肌組織Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白的表達

與正常對照組相比較，甲亢性心臟病組大鼠Cav3.1蛋白的表達明顯增高(P<0.01)，Cav3.2蛋白的表達明顯降低(P<0.01)，Cav3.3蛋白的表達無變化，見圖3、表3。

Figure 3. The protein expression of myocardial Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3 detected by immunohistochemical staining (×400).

圖3心肌組織Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白表達的免疫組化結(jié)果

6 Western blot測定各組大鼠心肌組織Cav3.1和Cav3.2蛋白的表達

與正常對照組相比較，甲亢性心臟病組大鼠Cav3.1蛋白的表達增高(P<0.05)，Cav3.2蛋白的表達明顯降低(P<0.01)，見圖4。

表3免疫組化檢測Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白在各組大鼠心肌的表達
Table 3. The protein expression of Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3 in the rat myocardial tissues detected by immunohistochemical staining (IA. Mean±SD.n=10)

ProteinNormal ControlHHDCav3.16 503.13±2 473.9641 786.10±13 251.00??Cav3.213 724.73±2 978.222 935.54±1 412.08??Cav3.31 598.05±597.701 554.12±733.50

**P<0.01vsnormal control group.

Figure 4. The protein expression of Cav3.1 and Cav3.2 in the rat myocardial tissues detected by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group.

圖4Westernblot檢測大鼠心肌組織Cav3.1和Cav3.2蛋白表達的結(jié)果

7 RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的mRNA表達

與正常對照組相比較，甲亢性心臟病組Cav3.1的mRNA表達增加(P<0.05)，Cav3.2的mRNA表達明顯降低(P<0.01)，Cav3.3的mRNA表達則沒有變化，見圖5。

討 論

甲狀腺素過量分泌可導(dǎo)致甲亢，甚至引起甲亢性心臟病。HHD患者在臨床上常出現(xiàn)心肌肥大和心律失常，主要表現(xiàn)為房顫、房撲和房室傳導(dǎo)阻滯等，嚴重的心律失常也可導(dǎo)致患者猝死。研究表明[9-12]，HHD猝死者心室肌Cx43蛋白的分布發(fā)生明顯改變，心肌細胞間失偶聯(lián)，進一步誘發(fā)心律失常。這提示HHD患者心律失常的原因不只局限于傳導(dǎo)系統(tǒng)，心室肌離子通道的改變也可能導(dǎo)致嚴重的心律失常。本實驗HHD組大鼠心臟臟器系數(shù)、左心室心肌細胞橫徑明顯增大都表明HHD大鼠出現(xiàn)心肌肥大，心電圖結(jié)果也表明可發(fā)生多種心律失常，以心房撲動、心動過速、房室、室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯等心律失常為主要表現(xiàn)。

Figure 5. The mRNA expression of Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3 in the myocardial tissues detected by RT-PCR. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group.

圖5RT-PCR檢測大鼠心肌組織Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3的mRNA表達

細胞內(nèi) Ca2+平衡在維持正常心律中起著重要作用，Ca2+平衡主要依賴于L型和T型鈣通道的正常表達。T型鈣通道家族包括3 個不同的亞基(α1 亞基α1G、α1H和α1I)，分別構(gòu)成了Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3這3種T型鈣通道亞型[13]。正常成年大鼠心肌中的Cav3.1和Cav3.2共同參與形成舒張期電流，但其分別參與何期電流的形成尚不明確，Cav3.3在心臟中極少表達[5]。文獻報道T 型鈣通道的上調(diào)或下調(diào)，在不同病理狀態(tài)下受到不同激素、細胞因子的調(diào)控，心肌肥厚時神經(jīng)限制性靜止因子(neuron-restrictive silencer factor，NRSF)可通過轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)T 型鈣通道的表達[14]；慢性缺氧時通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)可以上調(diào)心肌Cav3.2蛋白[15]；血管緊張素II可通過G蛋白偶聯(lián)受體上調(diào)心室肌Cav3.1的mRNA表達[16]，而雌激素可以負性下調(diào)Cav3.2的蛋白水平[17]。上述研究結(jié)果提示，不同病因?qū)е碌男呐K病，其T 型鈣通道的表達變化是不同的，其心律失常的發(fā)病機理有各自的特異性機制。鄭明奇等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞T型鈣通道表達增多，上調(diào)ICa-T，增加心臟自律性，觸發(fā)快速心律失常。Levitsky等[19]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)T型鈣通道的表達增加了心肌細胞興奮性并引發(fā)了期前收縮。而在大鼠心律失常模型中使用咪拉地爾、依福地平等T型鈣通道阻滯劑替代L型鈣通道阻滯劑可以有效減少大鼠心律失常的發(fā)生率[20-21]。上述研究結(jié)果提示心律失常的原因可能與心室肌T型鈣通道表達增多有關(guān)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果顯示心室肌Cav3.1表達較正常組明顯增加，Cav3.2表達明顯下降，提示長期高濃度甲狀腺素刺激可以正性或負性調(diào)節(jié)心室肌T型鈣通道各亞型的不同表達，改變心室肌細胞Ca2+平衡，誘發(fā)心律失常。

但也有文獻表明，T型鈣通道的表達減少可以解釋為一種保護機制，減少心肌細胞內(nèi)鈣超載所造成的細胞損傷[22]。由于2種T型鈣通道功能互相具有代償性，病理生理條件下Cav3.1和Cav3.2的異常表達與心律失常之間的機制并未完全闡明[6]。因此，關(guān)于HHD心律失常與T型鈣通道Cav3.1和Cav3.2表達異常之間的具體的生物學(xué)機制有待進一步研究加以明確。

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