趙金生，趙妍，2，趙美瞇，劉書源，侯平，郝麗英

（1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，沈陽110001；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽110032）

心肌細(xì)胞中的L-型鈣通道 （L-type Ca2+channel）對心臟具有重要意義。細(xì)胞外的Ca2+通過L-型鈣通道內(nèi)流，激活肌漿網(wǎng)上的雷尼丁受體（ryanodine receptor，RYR）使肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增高，稱為“鈣觸發(fā)鈣釋放”（Ca2+-induced Ca2+release，CICR）。該過程在心臟的興奮-收縮耦聯(lián)（excitation-contraction，EC）中起關(guān)鍵性作用。L-型鈣通道與某些心血管疾病的發(fā)生及治療密切相關(guān)，包括冠心病、高血壓、心律失常等常見的心血管系統(tǒng)疾病。

采用膜片鉗制技術(shù)對L-型鈣通道進(jìn)行電生理研究發(fā)現(xiàn)，以細(xì)胞貼附記錄模式和膜內(nèi)向外記錄模式測定L-型鈣通道活性時(shí)，當(dāng)用人工生理溶液代替細(xì)胞內(nèi)液時(shí)L-型鈣通道的活性顯著降低［1］，這種現(xiàn)象被稱為鈣通道的“run-down”現(xiàn)象，由此推測細(xì)胞內(nèi)存在維持L-型鈣通道基本活性的物質(zhì)［2］。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）是機(jī)體內(nèi)一種重要的蛋白激酶，廣泛參與機(jī)體多種生理活動(dòng)和病理變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［3～5］。有研究表明，CaMKⅡ通過與L-型鈣通道的IQ區(qū)域結(jié)合使其磷酸化，進(jìn)而使離子通道開放頻率增加，鈣電流增加［6］，同時(shí)通過易化調(diào)節(jié)擴(kuò)大L-型鈣通道對Ca2+依賴性信號(hào)通路的反應(yīng)［7，8］。牛心肌細(xì)胞質(zhì)粗提取物可以逆轉(zhuǎn)“rundown”L-型鈣通道的活性［2］，本研究觀察牛心細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物對“run-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)作用，并探討此作用是否與CaMKⅡ相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；DEAE sephadex A50離子交換樹脂（Pharmacia公司）；Protease（Sigma公司）；膠原酶Ⅰ型（Worthington biochemical公司）；CaMKⅡ抗體（Santa Cruz公司）；山羊抗小鼠二抗 （北京中杉試劑公司）；IX71倒置顯微鏡（Olympus公司）；P-97微電極拉制儀 （Sutter Instrument公司）；200B膜片鉗放大器（Axon公司）；MPC-325-2微操作器（Sutter Instrument公司）；1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器 （Axon公司）；PowerpacTMBasic型凝膠電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛心細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物的制備：取新鮮牛心的左心室組織約100 g，在冰浴中用剪刀剪成約1 cm3的小塊；加入預(yù)冷的生理鹽水200 mL，進(jìn)一步剪碎，4℃、500g離心10 min，重復(fù)2次，洗去血液；將組織塊置于組織勻漿機(jī)中，加入預(yù)冷的蛋白裂解緩沖液300 mL進(jìn)行組織勻漿，10 s×3次；勻漿液超聲提取蛋白，10 s×5次，盡量避免產(chǎn)生氣泡，冰浴中放置30 min后；4℃10000g離心20 min，取上清；4℃100000g離心30 min，取上清；用0.45 μm，微孔濾膜過濾。在濾液中加入預(yù)處理過的 DEAE-sephadex A50離子交換樹脂，冰浴中放置30 min進(jìn)行離子交換；抽濾，保留樹脂，棄去濾液；將樹脂用180 mmol/L的KCl溶液60 mL分3次洗脫，保留樹脂，棄去濾液；將樹脂用360 mmol/L的KCl溶液60 mL分3次洗脫，棄去樹脂，保留濾液，即得牛心細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物。采用IO液進(jìn)行透析，并用Bradford法測定蛋白濃度，實(shí)驗(yàn)中調(diào)整為所用的濃度，即1mg/mL。

1.2.2 Western blot檢測牛心細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物中CaMKⅡ的表達(dá)：取細(xì)胞質(zhì)溶液和細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物，以Brodford法測定樣品中蛋白含量，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印，加入CaMKⅡ一抗反應(yīng)，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，洗膜后按ECL說明書操作，發(fā)光檢測CaMKⅡ蛋白。

1.2.3 CaMKⅡ的制備：將大鼠CaMKⅡα的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后插入谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST） 融 合 蛋 白 表 達(dá) 質(zhì) 粒pGEX-6p-1 （GE healthcare biosciences，piscataway，NJ，USA）后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸埃希桿菌BL21（DE3）。用GST融合蛋白純化試劑盒（GE healthcare biosciences）制備和純化CaMKⅡ的GST融合蛋白。GST融合蛋白位點(diǎn)用 PreScissionTM蛋白酶（GE healthcare biosciences）在IO液中進(jìn)行酶切，獲得CaMKⅡ蛋白。采用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量，實(shí)驗(yàn)中調(diào)整為所用的濃度，即0.7 μmol/L。

1.2.4 大鼠心室肌細(xì)胞的制備：大鼠250～350 g，雌雄不限，1%戊巴比妥鈉110 mg/kg腹腔注射麻醉，在人工呼吸機(jī)支持下主動(dòng)脈插管。游離出心臟后置于Langendorff灌流裝置，進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌流。先用臺(tái)氏液灌流約3 min，繼以無鈣臺(tái)氏液灌流約6 min，然后用含膠原酶（0.22 mg/mL）的無鈣臺(tái)氏液消化20～30 min，最后用保存液沖洗殘酶約5 min。整個(gè)灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和。灌流結(jié)束后，取下心臟，放入室溫的KB液中機(jī)械分離細(xì)胞，得到單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)105 μm的鋼絲膜濾過后，加入蛋白酶于37℃水浴均勻震蕩4 min，用保存液清洗3次，800 r/min×3 min離心，以去除殘留酶，棄去上清后將分離的細(xì)胞置于4℃冰箱穩(wěn)定1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 單通道L型鈣電流的記錄：應(yīng)用膜片鉗放大器，利用細(xì)胞貼附式和膜內(nèi)向外式膜片鉗制技術(shù)記錄細(xì)胞膜鈣通道單通道電流。利用Ba2+負(fù)載記錄細(xì)胞膜上L-型鈣通道電流，通過L-型鈣通道的鋇電流由-70 mV至0 mV的去極化脈沖引出，波寬200 ms，刺激頻率0.5 Hz，數(shù)據(jù)經(jīng)由膜片鉗放大器記錄后以3.3 Hz的采集速率輸入計(jì)算機(jī)，減去漏電流。用pClamp10.0軟件記錄數(shù)據(jù)并以pClamp10.0分析軟件和自編的單通道分析軟件進(jìn)行分析。通道活性以通道開放頻率NPo表示。測定實(shí)驗(yàn)脈沖開始后5～105 ms期間的平均電流（I），并除以單通道電流幅值（i），根據(jù) I=N×Po×i，獲得通道開放頻率 NPo。其中N為膜片中的通道數(shù)目，Po為單一通道的開放頻率，i為單通道電流。

在細(xì)胞貼附模式下記錄鈣通道電流2 min，計(jì)算此時(shí)的通道開放概率NPo。然后通過緩慢抬高記錄電極的方法，將電極上的膜片從細(xì)胞膜上游離下來，形成膜內(nèi)向外的膜片記錄方式。以基本細(xì)胞內(nèi)液灌流膜片，誘導(dǎo)鈣通道的“run-down”現(xiàn)象1 min后，將膜片移入含有3 mmol/L ATP和含有不同蛋白成分的小灌流槽中。觀察L-型鈣通道電流變化，計(jì)算此時(shí)的NPo，與細(xì)胞貼附式下的NPo相比，算出相對開放概率百分?jǐn)?shù)，以此代表鈣通道活性的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 部分純化的牛心細(xì)胞質(zhì)提取物對“run-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)作用

首先通過細(xì)胞貼附模式記錄大鼠心肌細(xì)胞膜上的L-型鈣通道的基本活性，隨后采用膜內(nèi)向外的記錄模式將膜片移至細(xì)胞內(nèi)液中。如圖1A所示，L-型鈣通道的活性迅速降低，即出現(xiàn)“run-down”現(xiàn)象，此時(shí)L-型鈣通道的活性與細(xì)胞貼附記錄模式相比降低至（0.46±0.15）%。如圖1B 所示，在3 mmol/L的ATP存在下，牛心肌細(xì)胞質(zhì)提取物使L-型鈣通道的活性恢復(fù)至細(xì)胞貼附模式的（44.29±13.51）%，與“run-down”電流相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。加入 CaMKⅡ抑制劑 KN-62（1 μmol/L）后，L-型鈣通道的活性恢復(fù)僅為細(xì)胞貼附模式記錄的（1.30±0.94）%，與未加入KN-62組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），如圖1C所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛心肌細(xì)胞質(zhì)提取物對“run-down”L-型鈣通道活性有恢復(fù)作用，此作用可能與CaMKⅡ有關(guān)。

2.2 Western blot方法檢測心肌細(xì)胞質(zhì)提取物中CaMKⅡ

根據(jù)2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將牛心肌組織細(xì)胞質(zhì)提取物和用離子交換方法進(jìn)行純化得到的部分純化提取物采用Western blot方法檢測CaMKⅡ蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)提取物和部分純化提取物中均含有CaMKⅡ，結(jié)果如圖2所示。進(jìn)一步說明牛心肌細(xì)胞質(zhì)提取物及部分純化物對“run-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)與CaMKⅡ有關(guān)。

2.3 CaMKⅡ?qū)Α皉un-down”L-型鈣通道的調(diào)節(jié)

采用膜片鉗制技術(shù)膜內(nèi)向外記錄模式測定融合蛋白法制備的CaMKⅡ?qū)Α皉un-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CaMKⅡ?qū)-型鈣通道活性恢復(fù)至細(xì)胞貼附記錄模式的（71.59±14.76）%，與“run-down”電流相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果如圖3所示。直接證明了CaMKⅡ?qū)Α皉undown”L-型鈣通道活性具有恢復(fù)作用。不同成分對“run-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物和CaMKⅡ?qū)Α皉un-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)與“run-down”組相比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

L-型鈣通道是心肌細(xì)胞中的膜通道蛋白，在心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過程中發(fā)揮著重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用，具有重要的生理和病理學(xué)意義。L-型鈣通道可通過細(xì)胞內(nèi)PKA、PKG和PKC等多種第二信使通路進(jìn)行調(diào)節(jié)［9］。在心肌細(xì)胞中，CaMKⅡ調(diào)節(jié)著使Ca2+保持穩(wěn)態(tài)的多種下游靶蛋白，而最近的研究結(jié)果表明，CaMKⅡ在調(diào)節(jié)L-型鈣通道活性方面也發(fā)揮著非常重要的作用和意義［10，11］。

本課題組的前期研究工作已經(jīng)證明，牛心肌細(xì)胞質(zhì)提取物對“run-down”L-型鈣通道活性具有恢復(fù)作用，本實(shí)驗(yàn)希望進(jìn)一步研究提取物中的哪些成分對“run-down”L-型鈣通道的活性具有恢復(fù)作用。將牛心肌細(xì)胞質(zhì)提取物采用離子交換樹脂進(jìn)一步純化，收集不同的洗脫部分，采用膜片鉗單通道技術(shù)記錄L-型鈣電流，測定不同洗脫部分對“run-down”L-型鈣電流的恢復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，180～360 mmol/L KCl的洗脫部分對“run-down”L-型鈣通道活性具有恢復(fù)作用，表明該部分純化物中某些細(xì)胞因子具有維持L-型鈣通道基本活性的作用。在該部分純化物中加入CaMKⅡ抑制劑KN-62，并測定其對“run-down”L-型鈣電流的恢復(fù)作用，結(jié)果表明其恢復(fù)“run-down”L-型鈣通道活性的作用被阻斷，推測提取物中的CaMKⅡ?qū)謴?fù)“run-down”L-型鈣通道的活性具有重要作用。進(jìn)一步采用Western blot方法檢測牛心肌細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物中的CaMKⅡ，結(jié)果表明其中含有CaMKⅡ蛋白。有研究表明，L-型鈣通道在胞質(zhì)側(cè)存在CaMKⅡ的磷酸化位點(diǎn)［3］。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步采用融合蛋白的方法制備得到CaMKⅡ，并將CaMKⅡ進(jìn)行細(xì)胞貼附記錄模式和膜內(nèi)向外記錄模式的膜片鉗制實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步證明CaMKⅡ?qū)Α皉un-down”L-型鈣通道活性的恢復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CaMKⅡ可以使“run-down”L-型鈣通道的基本活性恢復(fù)至細(xì)胞貼附記錄模式的（71.59±14.76）%，說明CaMKⅡ具有維持心肌細(xì)胞L-型鈣通道基本活性的作用。

綜上所述，牛心細(xì)胞質(zhì)部分純化提取物對大鼠心肌細(xì)胞膜“run-down”L-型鈣通道的活性具有恢復(fù)作用，該作用與CaMKⅡ蛋白密切相關(guān)，CaMKⅡ?qū)τ诰S持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

［1］Kepplinger KJ，Romanin C.The run-down phenomenon of Ca2+channels.In Zamponi G，editors.Voltage-gated calcium channels［M］.New York：Kluwer Academic&Plenum Publishers，2005：219-230.

［2］Hao LY，Wang WY，Minobe E，et al.The distinct roles of calmodulin and calmodulin kinase II in the reversal of run-down of L-type Ca2+channels in guinea-pig ventricular myocytes［J］.J Pharmacol Sci，2009，111（4）：416-425.

［3］Huke S，Desantiago J，Kaetzel MA，et al.SR-targeted CaMKII inhibition improves SR Ca2+handling，but accelerates cardiac remodeling in mice overexpressing CaMKIIδC ［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50（1）：230-238.

［4］Sossalla S，F(xiàn)luschnik N，Schotola H，et al.Inhibition of elevated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II improves contractility in human failing myocardium［J］.Circ Res，2010，107（9）：1150-1161.

［5］Neef S，Dybkova N，Sossalla S，et al CaMKII-dependent diastolic SR Ca2+leak and elevated diastolic Ca2+levels in right atrial myocardium of patients with atrial fibrillation［J］.Circ Res，2010，106（6）：1134-1144.

［6］Couchonnal LF，Anderson ME.The role of calmodulin kinase II in myocardial physiology and disease ［J］.Physiology，2008，23：151-159.

［7］Erickson JR，JoinerMA，Guan X，et al.A dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKII by methionine oxidation［J］.Cell，2008，133（3）：462-474.

［8］Hudmon A，Schulman H，Kim J，et al.CaMKⅡ tethers to L-type Ca2+channels，establishing a local and dedicated integrator of Ca2+signals for facilitation［J］.J Cell Biol，2005，171（3）：537-547.

［9］Luo AT，Luo HY，Hu XW，et al.Hyposmotic challenge modulates function of L-type calcium channel in rat ventricular myocytes throughproteinkinaseC［J］.ActaPharmacolSin，2010，31（11）：1438-1446.

［10］Zhang W，Qi F，Chen DQ，et al.Ca/calmodulin-dependent protein kinase II delta orchestrates G-protein-coupled receptor and electric field stimulation-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37（8）：795-802.

［11］Neef S，Dybkova N，Sossalla S，et al.CaMKⅡ-dependent diastolic SR Ca2+leak and elevated diastolic Ca2+levels in right atrial myocardium of patients with atrial fibrillation［J］.Circ Res，2010，106（6）：1134-1144.