范紅杰，王倩，馮娟，于維東，張強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110004；2.附屬第一醫(yī)院干診科，沈陽(yáng)110001）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作為重要的組織工程種子細(xì)胞，具有多分化潛能，有促進(jìn)造血重建、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且易于接受外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)［1］。研究表明，BMSCs能重塑受損的神經(jīng)元通路和改善神經(jīng)功能缺失，可成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的種子細(xì)胞［2］。而單純的將BMSCs移植入體內(nèi)后的低成活率使BMSCs的治療效果不盡如人意。因此，如何減少其移植后凋亡的發(fā)生、提高BMSCs在體內(nèi)的存活率是目前干細(xì)胞移植治療腦缺血亟待解決的問(wèn)題。存活素（Survivin）是一個(gè)近期發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族成員，是至今發(fā)現(xiàn)分子量最小的、作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，且與細(xì)胞分裂、增殖等密切相關(guān)，有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管生成等作用［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Survivin基因修飾的BMSCs在離體微環(huán)境中能否延長(zhǎng)其生存能力并探討其機(jī)制，為新的干細(xì)胞抗凋亡移植策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM低糖型細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；0.25%EDTA胰蛋白酶，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清，購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；PBS（pH7.2）、TRIZOL（Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promege公司；PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖，均由日本TaKaRa公司提供；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周齡、體質(zhì)量100～150 g的清潔級(jí)雄性SD大鼠10只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（遼）2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)：取6～8周齡SD大鼠頸椎脫臼法處死，鈍性分離肌肉組織，完全暴露股骨和脛骨。從股骨和脛骨連接處小心分離，用止血鉗夾住股骨末端輕輕旋轉(zhuǎn)外拉取出股骨，立即置于裝有20 mL無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基的小燒杯中。依次取出另一側(cè)股骨和兩側(cè)的脛骨，剪去骨頭兩端的軟骨，抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基5 mL，將針頭插入骨髓腔反復(fù)沖洗，棄上清，用5 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至25 mL培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約24 h換液去除懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞和死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，并棄掉未貼壁細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞融合至80%～90%開(kāi)始傳代，標(biāo)記至P3代。分為3組：MSC組（正常血清培養(yǎng)）、BMSC組（無(wú)血清培養(yǎng)48 h）和BMSC-Survivin組（無(wú)血清培養(yǎng)48 h）。

1.2.2 真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs，以5×104/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合。轉(zhuǎn)染率的測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)率。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)Survivin基因表達(dá)情況：應(yīng)用Primer3設(shè)計(jì)引物，以待檢測(cè)細(xì)胞的cDNA為模板，引 物 為 ：5′-ACCGCATCTACACCTTCAA-3′和5′-AGTGCTTCCTATGCTCCT CTAT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度192 bp；內(nèi)參基因β-actin引物序列為5′-GTTGCGTTAC ACCCTTTCTT-3′和5′-CGAAGGCTCATCATTCAAA A-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度443 bp，由北京三博遠(yuǎn)志生物工程服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后按 94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃ 45 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物取10 μL加2 μL 6×上樣緩沖液，電泳，紫外成像儀獲取圖像，軟件分析。

1.2.4 BMSCs對(duì)去血清凋亡的檢測(cè)：待檢測(cè)的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞倒掉培養(yǎng)液，PBS洗后用0.25%胰酶消化1.5 min，倒掉胰酶，PBS小心洗1次，用PBS吹打1 min成細(xì)胞懸液，吸入Appendorf管，4℃、1000 r/min離心1 min，然后PBS重懸，4℃、1000 r/min離心2次，以PBS重懸后調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/mL，加入10 mL AnnexinⅤ混勻，室溫暗處溫育染色15 min，在上機(jī)前5 min加入10 mg/L碘化丙錠（propidium iodide，PI）染液5 mL。用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。分為3組：未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用方差分析或成組t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

接種初始的BMSCs為圓形，散在分布。48 h后細(xì)胞基本貼壁，并且有集落形成，進(jìn)行第1次換液。換液后清除懸浮細(xì)胞，BMSCs開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，第7天左右細(xì)胞可鋪滿瓶底。傳代后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞迅速增多，呈細(xì)長(zhǎng)狀有突起為漩渦狀生長(zhǎng)，其間分布有散在黑色顆粒可能為黏附性強(qiáng)的血細(xì)胞，胰蛋白酶消化傳代后逐漸消失，第3代時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞以梭形為主。

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組細(xì)胞的GFP表達(dá)率分別為1.3%、35.3%和32.8%（圖1）。

2.3 RT-PCR檢測(cè)Survivin基因表達(dá)結(jié)果

Survivin/β-actin比 值 MSC 組 、BMSC 組 和BMSC-Survivin 組分別為1.17、1.13 和1.75，Survivin基因表達(dá)量BMSC-Survivin組較MSC組和BMSC組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），MSC組和BMSC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 Survivin基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSC細(xì)胞凋亡的影響

去血清培養(yǎng)后BMSC組的早期凋亡率（2.84%）較 MSC 組（2.45%）升高（P<0.05）；血清培養(yǎng) 48 h后，BMSC-Survivin組（0.89%）較BMSC組的早期凋亡率降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

關(guān)于BMSCs的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，BMSCs具有來(lái)源廣泛、取材方便、體外分離和擴(kuò)增簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，自體移植無(wú)免疫排斥反應(yīng)，避開(kāi)了倫理學(xué)爭(zhēng)議，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。BMSCs能轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)外源性基因，近期已從單純的BMSCs移植發(fā)展到經(jīng)處理后再移植。但是BMSCs有其局限性，由于在體存活時(shí)間短，使其促進(jìn)血管再生成、分泌營(yíng)養(yǎng)因子等作用并不顯著，所以減少BMSCs的凋亡率是充分發(fā)揮干細(xì)胞潛能的關(guān)鍵。Survivin是一種凋亡抑制基因，Survivin在腫瘤組織中高表達(dá)，在分化成熟的正常組織中不表達(dá)［4］，可作用于細(xì)胞周期的G2/M期，與細(xì)胞分裂、增殖等密切相關(guān)，有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管生成等作用［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Survivin作為外源基因，通過(guò)脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至BMSCs，旨在發(fā)揮Survivin基因的抗凋亡作用，延長(zhǎng)BMSCs的生存時(shí)間，使細(xì)胞治療與基因治療相結(jié)合，充分發(fā)揮治療作用。

本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)內(nèi)外主流的Annexin V/PI方法檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞。細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別難度較大。Annexin V是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類如磷脂酰絲氨酸的特性，對(duì)磷脂酰絲氨酸有高度的親和性，因此該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸［6］。磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就已破壞。PI是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞中，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)將Annexin-V與PI匹配使用，建立一種用Annexin V在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合PI染料排除試驗(yàn)，以區(qū)分凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Survivin基因轉(zhuǎn)染后可降低大鼠BMSCs去血清培養(yǎng)后的早期凋亡率，使細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)。但是，其確切的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和證實(shí)。目前認(rèn)為，Survivin抗凋亡作用的機(jī)制可能為：（1）直接抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路受阻而起到抑制凋亡的作用，這是由于它含有的BIR2功能區(qū)，可在Bcl-2的下游與caspase-3和caspase-7結(jié)合而直接抑制其活性；（2）通過(guò)抑制位于染色體同一基因簇并且編碼序列廣泛互補(bǔ)的效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Survivin，從而減少細(xì)胞的凋亡，即Survivin與效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡；（3）抑制細(xì)胞色素C和caspase-8誘導(dǎo)的caspase的激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用；（4）與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4結(jié)合，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，該復(fù)合物使p21被釋放，從而使CDK4與Procaspase相互作用抑制細(xì)胞凋亡［8，9］。

此外，Liu等［10］的研究顯示轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞可能是由于提高干細(xì)胞的存活率和上調(diào)VEGF和bFGF保護(hù)因子的分泌來(lái)達(dá)到治療作用的，而VEGF和bFGF保護(hù)因子的升高可能是BMSCs生存時(shí)間提高的結(jié)果。如何提高治療作用的關(guān)鍵在于如何提高干細(xì)胞的生存時(shí)間，所以Survivin提高干細(xì)胞的生存時(shí)間是今后研究的重要方向，其機(jī)制需要再進(jìn)一步的研究，使轉(zhuǎn)基因治療缺血性腦血管病以及其他器官疾病的治療成為可能。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處：（1）沒(méi)有充分的證據(jù)證明BMSCs轉(zhuǎn)染后的多分化性和保護(hù)因子的高分泌，需要下一步的實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究；（2）Survivin基因轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)BMSCs抗凋亡能力的確切機(jī)制仍不明確，有待于進(jìn)一步研究和探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Survivin基因?qū)MSCs具有保護(hù)作用，可降低去血清培養(yǎng)的早期凋亡率，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，使解決BMSCs在體內(nèi)凋亡率高的問(wèn)題有了新的突破，從而為臨床治療提供了一個(gè)新的思路。

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