溫莉莉，韓芳，石玉秀

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

創(chuàng)傷后精神應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是由異常精神心理創(chuàng)傷所致的以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷并伴有易激惹情緒和回避行為的臨床表現(xiàn)為特征的長(zhǎng)期持續(xù)性精神障礙。研究表明PTSD患者腦部的海馬，杏仁核都有減小，其內(nèi)有神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［1，2］，而排斥性導(dǎo)向分子 A（repulsive guidance molecule A，RGMa）是一種新的軸突生長(zhǎng)抑制蛋白，在中樞神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起介導(dǎo)排斥性軸突導(dǎo)向信號(hào)和神經(jīng)管閉合、調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、存活、誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐塌陷而阻斷受損神經(jīng)再生等作用［3］。大鼠前額皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC），是認(rèn)知、記憶和情感的重要腦區(qū)［4～5］。mPFC在情緒反應(yīng)中起重要作用［6］，文獻(xiàn)報(bào)道PTSD腦萎縮可能由神經(jīng)元細(xì)胞凋亡所致［7］，從RGMa在PTSD mPFC的表達(dá)變化有可能揭示PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡發(fā)生機(jī)制。RGMa的激活可破壞生長(zhǎng)錐，使軸突回縮、生長(zhǎng)抑制［3］，研究RGMa在PTSD大鼠的表達(dá)變化可能揭示PTSD mPFC縮小的發(fā)病機(jī)制之一。本研究利用國(guó)際認(rèn)定的PTSD-SPS模型，采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡方法檢測(cè)PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元RGMa表達(dá)變化，為研究PTSD致細(xì)胞凋亡的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供成年健康雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量180～220 g，分籠喂養(yǎng)，自由飲食，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫保持在18～25℃，先將大鼠在實(shí)驗(yàn)室條件適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、PTSD-SPS組（7 d和14 d組），每組15只。

1.2 PTSD-SPS大鼠模型建立與行為學(xué)驗(yàn)證

采用2005年日本文部省召開(kāi)的“基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展”國(guó)際會(huì)議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型-SPS［8］。將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理：禁錮2 h；后強(qiáng)迫游泳20 min（水深40 cm，水溫25℃）；休息15 min后乙醚麻醉至意識(shí)喪失；無(wú)干擾常規(guī)喂養(yǎng)直至取材前通過(guò)行為學(xué)驗(yàn)證確認(rèn)符合PTSD后取材。

1.3 制備光鏡標(biāo)本

對(duì)SPS 7 d、14 d及正常對(duì)照組大鼠分別進(jìn)行心臟灌流固定。步驟如下述：大鼠經(jīng)2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，暴露心臟，左心室插管，剪開(kāi)右心耳，先以生理鹽水300 mL快速灌沖血道，后以4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定，取出腦組織，并浸入4%多聚甲醛續(xù)固定3 h，然后浸入Holt′s液（用0.01 mol/L PBS配制的40%蔗糖）中至沉瓶底。于恒冷箱切片機(jī)（萊卡）行冠狀切片，片厚8 μm，用于免疫組化染色。

1.4 RGMa免疫組織化學(xué)SABC法染色

冰凍切片經(jīng)吹干，依次用3%H2O2-dH2O漂洗10 min，PBS（含0.03%Triton X-100） 漂洗10 min×3次，5%BSA封閉20 min后，滴加兔多克隆抗體RGMa（工作濃度為1∶200，Santa Cruz Bio-technology）0.01 mol/L，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加生物素化羊抗兔IgG37℃，30 min，滴加SABC37℃，20 min，以上各步間均用0.01 mol/L PBS漂洗，之后DAB（武漢博士德公司）顯色，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡 （OLYMPUS，BX60，Japan） 觀察mPFC的RGMa表達(dá)，攝片。同倍率下，觀察5張連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件，記錄陽(yáng)性細(xì)胞吸光度（absorbance，A），對(duì)以上免疫組化顯色切片進(jìn)行半定量分析。

1.5 免疫印跡（Western blot）

脫頸法處死大鼠，冰上快速取出正常對(duì)照組及SPS 7 d、14 d組大鼠mPFC，組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，12000 r/min，取上清；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度；每例標(biāo)本提取蛋白50 μg，10%SDS PAGE變性凝膠電泳，濃縮膠90 V、30 min和分離膠110 V、120 min；恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4℃過(guò)夜，5%脫脂奶粉封閉90 min；加入兔多克隆多抗體RGMa（工作濃度為1∶200）中孵育，4℃過(guò)夜；IgG抗體-HRP多聚體孵育2 h；ECL發(fā)光，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH的平均光密度（OD）的比值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 RGMa免疫組織化學(xué)染色

顯色結(jié)果表明，RGMa在正常對(duì)照組和模型組均有表達(dá)，且陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)在神經(jīng)元和突起內(nèi)，見(jiàn)圖1。分析結(jié)果顯示，SPS 7 d組和14 d組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3組陽(yáng)性細(xì)胞OD值分別是（0.44±0.002）、（0.63±0.015）和（0.51±0.009），SPS 7 d組RGMa的表達(dá)增多，SPS14 d組RGMa表達(dá)稍有降低，但較對(duì)照組仍明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 SPS大鼠mPFC組織蛋白提取及免疫印跡法測(cè)定RGMa

免疫印跡測(cè)試顯示，在33 kDa處有陽(yáng)性條帶。分析結(jié)果表明，對(duì)照組的mPFC RGMa有一定表達(dá)，SPS 7 d組表達(dá)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SPS14 d組表達(dá)較7 d組減少，較正常組增多（圖3，圖 4）。

3 討論

現(xiàn)代社會(huì)壓力日趨增大，巨大自然災(zāi)害（海嘯、地震、洪災(zāi)等）近年頻發(fā)，故此PTSD受到國(guó)內(nèi)外極大關(guān)注［9］。PTSD-SPS大鼠模型是2005年日本文部省召開(kāi)的“基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展”國(guó)際會(huì)議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型［8］，該模型以環(huán)境條件刺激（強(qiáng)迫性游泳）作為應(yīng)激刺激，SPS大鼠能表現(xiàn)出PTSD相似的臨床行為學(xué)改變［10］，更適于PTSD的研究。目前國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)PTSD患者M(jìn)RI檢查見(jiàn)海馬體積縮小、萎縮［11，12］。所以推測(cè)記憶的異?？赡芘c海馬體積減小有關(guān)。杏仁核活躍，PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突增多，推測(cè)恐怖增強(qiáng)可能與此有關(guān)［2，13］。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)PTSD的研究主要集中在行為學(xué)和內(nèi)分泌的改變，對(duì)細(xì)胞通路的研究較少。RGM是分子量為33/35 kDa的排斥導(dǎo)向分子，其家族成員有RGMa、RGMb RGMc，其中 RGMa、在成年大鼠神經(jīng)元有表達(dá)，在腦損傷時(shí)表達(dá)增強(qiáng)［11］。RGMa的高親和力受體neogenin主要表達(dá)于發(fā)育中和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)［14］，而RGMa可在創(chuàng)傷條件下與其高親和力受體結(jié)合，通過(guò)激活RhoA-ROCK（RhoA-Rhoassociated kinase）而使神經(jīng)元生長(zhǎng)錐崩塌，抑制大腦神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)［11，12，15］。因此，RGMa 參與神經(jīng)元的再生，mPFC在情感反應(yīng)中起到核心作用。研究RGMa在mPFC的表達(dá)對(duì)揭示PTSD凋亡機(jī)制有一定意義。

本實(shí)驗(yàn)觀察到RGMa在PTSD大鼠mPFC的表達(dá)增加，RGMa在SPS后表達(dá)增高尤其是SPS 7 d表達(dá)量最多，提示 RGMa參與PTSD的應(yīng)激過(guò)程。RGMa是一種新的軸突生長(zhǎng)抑制蛋白，可誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐塌陷進(jìn)而阻斷受損神經(jīng)再生等作用［3］，致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后神經(jīng)元的再生困難，在哺乳動(dòng)物腦和脊髓損傷后其神經(jīng)元中誘導(dǎo)抑制性或排斥性導(dǎo)向分子表達(dá)增多［14］。研究報(bào)導(dǎo)阻斷RGMa蛋白后能使neogenin與RGMa分離，促使neogenin與netrin-1結(jié)合，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)［16］。我們推測(cè)PTSD后情感改變、恐懼增強(qiáng)，與創(chuàng)傷后RGMa表達(dá)增多有關(guān)，RGMa表達(dá)增多可能使神經(jīng)元生長(zhǎng)錐塌陷抑制神經(jīng)元再生，使PTSD神經(jīng)元萎縮、凋亡。RGMa在創(chuàng)傷條件下與其高親和力受體結(jié)合可通過(guò)激活RhoAROCK（RhoA-Rho-associated kinase）而使神經(jīng)元生長(zhǎng)錐崩塌，抑制腦神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)［15］，進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞萎縮甚至凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RGMa在mPFC的細(xì)胞凋亡時(shí)有很強(qiáng)的過(guò)表達(dá)，我們推測(cè)RGMa/neogenin信號(hào)有可能是PTSD細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控信號(hào)。SPS大鼠mPFC中RGMa表達(dá)增高，可能通過(guò)RhoA-ROCK（RhoA-Rho-associated kinase）通路抑制神經(jīng)元再生和修復(fù)，加重PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。本研究為闡明PTSD發(fā)病機(jī)制提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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