王振華，劉云會，馬騰，喻博，薛一雪

（中國醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院生理學教研室，沈陽110001；2.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110004；3.基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，沈陽110001）

缺血性腦血管疾病具有較高的發(fā)病率和致死率，嚴重威脅著人們的健康。缺血的腦組織在治療中或多或少得以再灌注，使血流再通并降低腦缺血造成的神經(jīng)細胞傷害，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生也是困擾臨床醫(yī)生的一個難題［1］。再灌注損傷包括神經(jīng)細胞代謝紊亂、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性增加、白細胞浸潤等，嚴重還可引起腦水腫和溶栓后的顱內出血［2］。諸多研究表明BBB結構和功能的改變是缺血再灌注早期一個重要的病理過程，BBB通透性的增加將加重缺血腦組織的損傷［3］。BBB主要由毛細血管內皮細胞、基膜和星形膠質細胞足板組成，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)定的重要結構。緊密連接相關蛋白claudin-5和occludin在BBB通透性的調節(jié)中起著至關重要的作用［4］。近來研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷中亦伴有蛋白激酶 Cδ（protein kinase C δ，PKCδ）信號通路的激活［5］。為探討大鼠局灶性腦缺血再灌注早期BBB通透性的動態(tài)變化及機制，本研究利用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，檢測再灌注2 h內緊密連接蛋白claudin-5，occludin和PKCδ蛋白表達水平的變化及其與BBB通透性變化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康雄性Wistar大鼠96只，體質量（250±10）g，由中國醫(yī)科大學動物中心提供。隨機分成6組：假手術組、缺血1 h組、缺血2 h組、缺血再灌注0.5 h組、缺血再灌注1 h組、缺血再灌注2 h組。claudin-5、occludin和β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，PKCδ抗體購自美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型制備：參照文獻［6，7］，采用大腦中動脈線栓法制作局灶性腦缺血模型。大鼠用10%的水合氯醛（350 mg/kg，i.p.）麻醉后，沿頸前正中部切開皮膚，鈍性分離左側頸動脈鞘，分離出頸內、頸外動脈，結扎翼腭、頸外動脈。將4-0單絲尼龍魚線自頸總動脈遠端切口處向頸內動脈插入約19～22 mm，阻塞大腦中動脈近端血流。假手術組魚線進入到頸動脈分叉處即可。再灌注時，抽出尼龍線，使血流再通。在手術過程中連續(xù)監(jiān)測動物體溫，使其維持在37.0℃。大鼠蘇醒后，參照Longa等［8］的方法進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分的動物可選為實驗動物。

1.2.2 BBB通透性的測定：用伊文思藍（Evans blue，EB）滲透法定量分析BBB通透性變化［9］。制備好缺血模型后，取腦前0.5 h股靜脈注射2%EB。到實驗組各時間點，麻醉下用肝素化的生理鹽水對大鼠進行心臟灌流，當右心房流出的液體變清澈即可斷頭。將取出的腦組織稱重，浸入甲酰胺（1 mL/100 mg），放到60℃水浴箱內孵育24 h。用分光光度計檢測波長為620 nm的吸光度，根據(jù)繪制的EB標準曲線定量分析染料的含量。

1.2.3 免疫組化：免疫組化方法檢測各實驗組和對照組腦缺血組織緊密連接蛋白claudin-5和occludin的表達及分布。大鼠用10%的水合氯醛麻醉后，用肝素化的生理鹽水進行心臟灌注，然后用4%多聚甲醛灌注，固定好后斷頭取腦缺血區(qū)額頂葉，將標本后固定24 h，依次浸入15%、20%、30%蔗糖溶液中脫水。OCT包埋劑包埋，用冰凍切片機冠狀連續(xù)切厚度為12 μm的缺血腦組織切片，進行免疫組化染色。claudin-5、occludin的一抗?jié)舛葹?∶150，其余常規(guī)操作按說明書進行，免疫組化結果用Motic Images Advanced3.2圖像分析系統(tǒng)采集圖片，測平均光密度值進行claudin-5、occludin表達的定量分析。

1.2.4 Western blot檢測：各實驗組和對照組迅速斷頭取腦，提取腦缺血區(qū)額頂葉組織加入裂解緩沖液，4℃17000 r/min離心15 min，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的定量。各組取等量蛋白上樣后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，將膜分別與1∶500稀釋的claudin-5、occludin和PKCδ抗體4℃孵育過夜，室溫下與相應二抗孵育2 h，ECL法顯色。以β-actin為內對照，所得膠片掃描后，采用Fluor Chen2.0軟件進行定量分析，測得各條帶的整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 BBB通透性的變化

伊文思藍滲透法結果顯示，腦組織中EB的含量在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、再灌注1 h、再灌注2h 時為0.107 8±0.0101，0.167 9±0.0125，0.216 9±0.020 8，0.298 7±0.0163，0.3163±0.021 6，與假手術組（0.0552±0.0060）比較均顯著升高（P<0.01），EB的含量在再灌注2 h時達到峰值。

2.2 claudin-5與occludin的分布和表達

claudin-5和occludin蛋白主要表達在大鼠腦組織微血管內皮細胞中，在假手術組claudin-5和occludin呈強陽性表達，并沿血管內皮連續(xù)分布（圖1A，1G）。隨著缺血和再灌注時間延長，claudin-5在缺血1 h組、缺血2 h組、再灌注0.5 h組、再灌注1 h組、再灌注2h 組表達為0.371 9±0.0153、0.336 9±0.014 6、0.324 4±0.011 6、0.2892±0.013 8、0.2690±0.010 4，與假手術組（0.4405±0.0185）比較顯著降低（P<0.01）；occludin在缺血1h組、缺血2h組、再灌注0.5 h組、再灌注1 h組、再灌注2 h組表達為0.3331±0.0135、0.325 7±0.0090、0.3081±0.015 4、0.2954±0.0149、0.2690±0.0121，與假手術組（0.4005±0.009 9）比較顯著降低（P<0.01），且 claudin-5 和occludin沿血管呈不連續(xù)分布（圖1B～1F，1H～1L），以缺血再灌注2 h表達量最低（圖1F，1L）。

2.3 claudin-5、occludin和PKCδ蛋白的表達

采用Western blot法進一步證實缺血再灌注損傷早期對claudin-5和occludin蛋白表達的影響，如圖2所示，與假手術組比較，claudin-5和occludin蛋白從缺血1 h開始到再灌注2 h這一過程中表達水平均顯著下降，在缺血再灌注2 h時下降最為明顯（P<0.01）。而PKCδ蛋白表達的趨勢則是隨著缺血和再灌注時間延長逐漸升高。缺血1 h組、缺血2 h組、再灌注0.5 h組、再灌注1 h組、再灌注2 h組中PKCδ蛋白表達與對照組比較均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

3 討論

本研究利用大鼠局灶性腦缺血模型證明，缺血再灌注損傷早期引起B(yǎng)BB通透性顯著增加。隨著缺血再灌注時間的延長，BBB的開放程度逐漸增加，屏障作用減弱，在此過程中緊密連接相關蛋白claudin-5和occludin表達顯著下調，而PKCδ蛋白表達顯著上調。緊密連接相關蛋白及PKCδ蛋白表達變化與BBB通透性下降的時相變化基本一致。

研究表明缺血再灌注損傷與BBB結構和功能的繼發(fā)性破壞密切相關，BBB屏障功能的減弱及通透性增加可引起嚴重的血管源性腦水腫和其他并發(fā)癥［3］。有文獻報道大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷早期有效的治療時間在缺血后3 h之內［10］，而我們以往研究已探討了缺血2 h后再灌注3 h至120 h期間BBB通透性的變化及機制［7］，目前局灶性腦缺血再灌注2 h以內BBB的開放及緊密連接變化情況研究甚少，故探討短暫的腦缺血再灌注過程中BBB變化的時程對缺血性腦血管疾病的治療有一定指導意義。本研究表明在缺血1 h后，BBB的通透性即顯著增加，隨著再灌注時間的延長，BBB的破壞逐漸加劇，進一步證實了BBB的滲漏參與了早期的缺血再灌注損傷。

緊密連接相關蛋白是維持BBB完整性的重要因素，其結構和功能的破壞將引起B(yǎng)BB通透性增加，甚至腦水腫。其中claudin-5和occludin蛋白是調節(jié)物質通過細胞間緊密連接的最關鍵成分。本研究結果顯示在缺血再灌注早期腦微血管內皮細胞中claudin-5、occludin分布連續(xù)性和表達量均發(fā)生改變，其表達下調的時程與BBB開放的時程基本符合，claudin-5、occludin在缺血1 h后表達即顯著下調，一直持續(xù)到缺血再灌注2 h。BBB的通透性增加除與緊密連接開放有關之外，還受細胞旁等途徑影響，本研究提示缺血再灌注早期BBB的開放可能與緊密連接claudin-5和occludin的表達下調有關。

研究表明PKCδ信號轉導通路快速地激活和蛋白表達上調可加重腦缺血再灌注損傷，應用PKCδ特異性抑制劑可顯著減弱再灌注時神經(jīng)細胞的損害。為深入探討缺血再灌注2 h內BBB開放的機制，我們應用Western blot方法檢測腦缺血再灌注組織中PKCδ蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血1 h后，PKCδ蛋白表達顯著升高，一直持續(xù)到再灌注2 h，其上調的變化趨勢與BBB開放和緊密連接蛋白表達下降的趨勢基本一致，且有文獻報道應用PKCδ選擇性抑制劑δV1-1可增加緊密連接ZO-1、occludin與細胞骨架之間的聯(lián)系，減弱對緊密連接屏障的損傷；而PKCδ的激活可顯著降低ZO-1和occludin的表達和引起緊密連接的開放［11］，而在血視網(wǎng)膜屏障、血腦脊液屏障等多種內皮細胞也發(fā)現(xiàn)PKCδ在緊密連接相關蛋白分布及表達上起重要調節(jié)作用。在血腦脊液屏障PKCδ可通過增加MMP-9活性，來降低緊密連接相關蛋白表達，使血腦脊液屏障通透性增加［5，11］。因此我們推測PKCδ通路的激活可能通過降低claudin-5、occludin表達參與腦缺血再灌注早期BBB通透性的增加。我們將在后續(xù)的研究中深入探討PKCδ通路在BBB開放過程中具體的細胞內信號轉導機制。

在腦缺血再灌注早期若能有效地減輕BBB的破壞，將緩解再灌注引起的腦組織損傷。本研究證明了腦缺血再灌注早期緊密連接蛋白claudin-5、occludin表達均下降，而PKCδ表達則顯著升高，它們3者可能參與了再灌注早期BBB的開放，這為腦缺血再灌注損傷的治療提供了一定的實驗基礎。

［1］馮社軍，劉鳴，李衛(wèi)征，等.腦卒中患者復發(fā)及其影響因素研究［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，29（5）：983-985.

［2］朱偉偉，王鵬程，李小松.IL-17在缺血再灌注損傷中作用的研究進展［J］.首都醫(yī)科大學學報，2011，32（2）：304-308.

［3］Yang Y，Rosenberg GA.Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease［J］.Stroke，2011，42（11）：3323-3328.

［4］Sandoval KE，Witt KA.Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke［J］.Neurobiol Dis，2008，32（2）：200-219.

［5］Kim JH，Kim JH，Jun HO，et a1.Inhibition of protein kinase Cδ attenuates blood-retinal barrier breakdown in diabetic retinopathy［J］.Am J Pathol，2010，176（3）：1517-1524.

［6］Wang Z，Xue Y，Jiao H，et al.Doxycycline-mediated protective effect against focal cerebral ischemia-reperfusion injury through modulation of tight junctions and PKCδ signaling in rats［J］.J Mol Neurosci，2012，47（1）：89-100.

［7］Jiao HX，Wang ZH，Liu YH，et al.Specific role of tight junction proteins claudin-5，occludin，and ZO-1 of the blood-brain barrier in a focal cerebral ischemic insult［J］.J Mol Neurosci，2011，44（2）：130-139.

［8］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reverisible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［9］Wang ZH，Xue YX，Liu YH.The modulation of protein kinase A and heat shock protein 70 is involved in the reversible increase of bloodbrain tumor barrier permeability induced by papaverine ［J］.Brain Res Bull，2010，83（6）：367-373.

［10］Brown RC，Morris AP，O′Neil RG.Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells［J］.Brain Res，2007，1130（1）：17-30.

［11］Angelow S，Zeni P，H觟hn B，et al.Phorbol ester induced short-and long-term permeabilization of the blood-CSF barrier in vitro［J］.Brain Res，2005，1063（2）：168-179.