舒承倩，吳晶魁，周 瀅△

(1重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)藥研究室， 重慶 400016； 2天津醫(yī)科大學， 天津 300070)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)主要由于酒精的大量攝入，繼而引發(fā)的中毒性肝損傷，是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率和死亡率的一個重要原因[1]。在過去的數(shù)十年中，研究人員認為ALD的發(fā)病機制主要與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腸道微生態(tài)、細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通路以及先天免疫系統(tǒng)有關(guān)[2]。在ALD的初期，炎癥反應(yīng)起著重要的作用[3]，釋放的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)，擴大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝損傷[4]。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酸(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)是反映肝功能異常的重要指標。值得注意的是，最近的研究證實核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)對減輕氧化應(yīng)激具有決定性的作用，長期的酒精攝入會導(dǎo)致Nrf2及相關(guān)靶目標表達的下調(diào)[5-6]。抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在肝臟抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)被廣泛的認為是氧化應(yīng)激的標記物，是脂質(zhì)過氧化物及脂質(zhì)自身增加引起的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和酒精誘導(dǎo)的肝損傷表現(xiàn)相關(guān)的一個有力證據(jù)[7-8]。

趕黃草(PenthorumchinensePursh)作為四川古藺解酒道地藥材，具有抗氧化和保肝護肝的藥理作用[9-10];同樣作為解酒專藥的葛花(Puerariaeflos)，其提取的活性成分均有抗炎作用[11]。趕黃草和葛花為治療酒精性肝損傷的常用藥，在臨床運用中分別治療酒精性肝病，保肝療效顯著。但二藥配伍合用能否共同降低炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，鮮有相關(guān)報道，有待驗證。本實驗運用real-time PCR 和Western blot方法檢測乙醇誘導(dǎo)的L-02肝細胞損傷模型中TNF-α、IL-6、Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白的表達，探討其可能的作用機制，為指導(dǎo)臨床提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株和實驗動物 人正常肝細胞L-02購自中國科學院上海細胞庫，由重慶醫(yī)科大學藥學院提供。SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重在200～220 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號為SYXK(渝)2012-0001。

1.2藥物和試劑 趕黃草和葛花飲片均購自太極集團重慶桐君閣大藥房，藥物經(jīng)重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院曹緯國副教授鑒定為正品。兔抗人TNF-α多克隆抗體和兔抗人IL-6多克隆抗體(BIOSS，貨號分別為bs-2081R和bs-4539R，規(guī)格均為0.1 mL)； 兔抗人血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)多克隆抗體和兔抗人Nrf2多克隆抗體(Affinity，貨號分別為AF5393和AF0639，規(guī)格均為50 μL)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green(TaKaRa)；ALT、AST、SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(Biological Industries)；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶和1%雙抗(HyClone)；MTT和DMSO(Sigma)。

1.3儀器 PCR儀(Applied Biosystems)；臺式蒸汽滅菌鍋(LabTech)；低溫離心機(Sigma)；ND-2000核酸蛋白分析儀(NanoDrop)；倒置顯微鏡(Leica)；超凈臺(中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；數(shù)顯三用恒溫水箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)；Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；多功能酶標儀(BioTek)。

2 方法

2.1藥物制備 趕黃草配伍葛花1∶1組、2∶1組和1∶2組成人臨床用量分別為0.5 g/kg、0.75 g/kg和0.75 g/kg，按“動物與人體每公斤體重折算系數(shù)表”(成人與大鼠折算系數(shù)為6.25)計算,大鼠相對于成人的臨床等效劑量分別為3.13 g/kg、4.69 g/kg和4.69 g/kg，此為低劑量，按照1、2和4倍來確定低、中、高劑量。實驗選擇4倍高劑量為大鼠灌胃劑量。凱西萊(tiopronin)藥物組按60 mg/kg給藥,生理鹽水組按照10 mL/kg給藥。

2.2含藥血清制備 50只SPF級清潔SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組：生理鹽水組，趕黃草配伍葛花1∶1組、2∶1組和1∶2組，凱西萊組。各組均按每天10 mL/kg 的量給藥，每天2次，連續(xù)3 d，最后1次灌胃2 h后用乙醚麻醉，無菌條件下心臟采血。血液靜置4 h，3 000 r/min離心15 min后收集含藥血清。56 ℃、30 min水浴滅活，0.22 μm過濾器過濾收集含藥血清。

2.3細胞培養(yǎng) L-02細胞在5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(內(nèi)含RPMI-1640和1%雙抗)中培養(yǎng)。每日在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，細胞隔天換液1次，細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%左右時進行傳代。

2.4細胞干預(yù) 倒置顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%時加入0.25%胰酶消化，進行實驗。實驗分為6組：空白對照組，模型組，趕黃草配伍葛花1∶1組、2∶1組和1∶2組，凱西萊組?？瞻讓φ战M和模型組給予含10%生理鹽水組大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，1∶1組、2∶1組和1∶2組分別給予相應(yīng)組別的10%趕黃草配伍葛花的含藥血清，凱西萊組給予10%凱西萊含藥血清。給藥1 h后，除空白對照組繼續(xù)用含有10%生理鹽水組大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)基外，其余各組均給予含終濃度100 mmol/L乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基。各組細胞在5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。

2.5MTT法檢測含藥血清對乙醇損傷 L-02 細胞活力的影響 將處于對數(shù)生長期且存活率大于90%的L-02細胞用完全培養(yǎng)基混成1×108/L的細胞懸液，接種于96孔板(90 μL)，設(shè)調(diào)零組(含10%生理鹽水血清的完全培養(yǎng)基)、空白對照組、模型組、1∶1組、2∶1組、1∶2組和凱西萊組。每組設(shè)6個復(fù)孔，48 h后細胞貼壁達90%以上，空白對照組、調(diào)零組和模型組加入完全培養(yǎng)基代替，其余各組加入相應(yīng)的10%含藥血清進行預(yù)處理。給藥1 h后，除調(diào)零組和空白對照組加入完全培養(yǎng)基外，其余各組分組給予終濃度100 mmol/L乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，各孔10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液，所有孔加入濃度為5 g/L 的MTT (每孔20 μL)孵箱孵育4 h后，棄上清加入150 μL DMSO充分溶解結(jié)晶，振蕩10 min，酶標儀上490 nm波長處檢測吸光度(A)值。實驗孔實際A值=實驗孔實測A值-調(diào)零孔A值。細胞活力(%)=(實驗組A值-調(diào)零組A值)/(正常組A值-調(diào)零組A值)。

2.6含藥血清對乙醇損傷L-02細胞ALT、AST、MDA及SOD水平的影響 將L-02細胞接種于48孔板中，接種體積為每孔180 μL，加樣和造模體積為每孔20 μL，其余方法均同2.5。培養(yǎng)24 h后，分別取細胞上清液和提取肝細胞，用試劑盒及酶標儀檢測ALT(510 nm波長)、AST(510 nm波長)、MDA(530 nm波長)和SOD(450 nm波長)的A值，計算相應(yīng)指標。

2.7Real-time PCR法檢測L-02肝細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、Nrf2和HO-1的mRNA表達 L-02細胞按每孔1×108/L接種于6孔板，每孔2.5 mL，待細胞生長至80%～90%融合時，吸棄培養(yǎng)基，各組加入相應(yīng)含藥血清及試劑，24 h后收集細胞。提取細胞總RNA并收集樣本：移入 1.5 mL EP管中，加1 mL TRIzol，冰上裂解 20 min，加0.2 mL氯仿，漩渦振蕩混勻；4 ℃離心機中12 000 r/min 離心5 min；轉(zhuǎn)上層水相(約 400 μL)于另一1.5 mL EP 管中；加等體積異丙醇，振蕩混勻；4 ℃離心機中12 000 r/min離心20 min；棄上清，加預(yù)冷的75%乙醇1 mL；4 ℃，12 000 r/min離心 5 min；棄上清，加無水乙醇 1 mL；4 ℃，12 000 r/min離心5 min；棄上清，空氣干燥 5～10 min; 溶于 40 μL DEPC 水中，使用NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀測RNA濃度并校準，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR步驟按照TaKaRa說明書操作，運用2-ΔΔCt方法計算用藥組與對照組的比值。β-actin、TNF-α、IL-6、Nrf2和HO-1的引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

2.8Western blot檢測L-02肝細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、Nrf2和HO-1蛋白的表達 L-02細胞接種、培養(yǎng)及藥物處理同2.7。將細胞收集后用蛋白裂解液裂解細胞，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心 20 min；提取的細胞蛋白用BCA法測定蛋白濃度。灌制凝膠，12%分離膠，5%濃縮膠; 上樣量 50 μg，電泳結(jié)束后取出凝膠，和相同大小的PVDF置于3層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)移液，電轉(zhuǎn)300 mA 約 90 min。取出 PVDF 膜，晾干后，置于 95% 乙醇中固定，TBST洗 5 min; 放入 5% 脫脂奶粉中封閉，室溫下1 h；TBST洗3次，每次10 min，加 I 抗，室溫下3～4 h； TBST洗3次，每次10 min; 加 II 抗，室溫下1～2 h； TBST洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光，并使用ImageJ統(tǒng)計條帶強度。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 含藥血清對乙醇損傷的L-02細胞活力的影響

與空白對照組相比，模型組細胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明造模成功；與模型組相比，1∶1組、2∶1組和1∶2組及凱西萊組的細胞活力均明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各治療組間的差異無統(tǒng)計顯著性，見圖1。

Figure 1. The effects of drug-containing serum on the viability of L-02 cells induced by ethanol. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖1含藥血清對乙醇誘導(dǎo)損傷的L-02細胞存活率的影響

2 含藥血清對乙醇損傷的L-02細胞中ALT、AST、MDA及SOD水平的影響

酶標法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組的ALT、AST和MDA水平均明顯增高，SOD活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，1∶1組、2∶1組、1∶2組和凱西萊組的ALT、AST和MDA水平均明顯降低，SOD活性明顯增高(P<0.01)，見表2。

3 Real-time PCR的結(jié)果

與空白對照組相比，模型組TNF-α和IL-6的mRNA表達均顯著上調(diào)，Nrf2和HO-1 的mRNA表達均顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，1∶1組、2∶1組、1∶2組和凱西萊組TNF-α和IL-6的mRNA表達均顯著下調(diào)，Nrf2和HO-1的mRNA表達均顯著上調(diào)(P<0.01)，見表3、4。

表2 含藥血清對乙醇損傷的L-02 細胞中ALT、AST、MDA及SOD水平的影響Table 2. The levels of ALT, AST, MDA and SOD in the L-02 liver cells (Mean±SD. n=6)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

表3 含藥血清對乙醇損傷的L-02 細胞中TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達的影響Table 3. The expression of TNF-α and IL-6 at mRNA and protein levels in the L-02 liver cells (Mean±SD. n=3)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

表4 含藥血清對乙醇損傷的L-02 細胞中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白表達的影響Table 4. The expression of Nrf2 and HO-1 at mRNA and protein levels in the L-02 liver cells (Mean±SD. n=3)

**P<0.05vscontrol group;##P<0.05vsmodel group;△△P<0.05vs1∶1 group.

4 Western blot結(jié)果

與空白對照組相比，模型組TNF-α和IL-6 的蛋白表達均顯著上調(diào)，Nrf2和HO-1 的蛋白表達均顯著下調(diào)(P<0.01);與模型組相比，1∶1組、2∶1組、1∶2組TNF-α和IL-6的蛋白表達均顯著下調(diào)，Nrf2和HO-1的蛋白表達均顯著上調(diào)(P<0.01),其中1∶1組升高Nrf2蛋白效果最好(P<0.01);凱西萊組的HO-1蛋白與各治療組間的差異無統(tǒng)計學顯著性,見圖2、3及表3、4。

Figure 2. The effects of drug-containing serum on protein expression of TNF-α and IL-6 in the L-02 liver cells induced by ethanol.

圖2含藥血清對乙醇誘導(dǎo)損傷的L-02細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達的影響

Figure 3. The effects of drug-containing serum on protein expression of Nrf2 and HO-1 in the L-02 liver cells induced by ethanol.

圖3含藥血清對乙醇誘導(dǎo)損傷的L-02細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

討 論

ALD是一種由于長期酒精攝入而引發(fā)的肝臟損傷疾病，伴隨著高發(fā)病率和死亡率[12]。ALD的發(fā)病機理錯綜復(fù)雜，涉及炎癥因子及肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)等多通路、多系統(tǒng)的復(fù)雜病理過程，但炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激正是 ALD發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的主要環(huán)節(jié)[13]。目前被廣為接受的是以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”學說[14]，該學說認為，氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)過氧化和炎癥細胞因子的釋放等形成“二次打擊”，誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝細胞變性壞死及肝纖維化和肝硬化[15]。而近來有研究認為，長期攝入酒精使肝細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，其產(chǎn)物 4-HNE 作為一種肝細胞致敏因子，誘導(dǎo)酒精性肝損傷[16]。

大量研究表明，炎癥介質(zhì)在酒精性肝病的發(fā)病過程中起著重要的作用。主要參與的關(guān)鍵炎癥因子為TNF-α和IL-6[3]。TNF-α和IL-6是促炎細胞因子，肝臟是其重要的靶器官，其參與體內(nèi)的炎癥、免疫反應(yīng)過程[17]。當細胞受到氧化應(yīng)激或者酒精刺激時，釋放大量的細胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-6和IL-1β等。同時，氧化應(yīng)激對細胞的刺激促使其產(chǎn)生大量的ROS[18]，并啟動體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶點Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。作為目前發(fā)現(xiàn)的細胞抗氧化應(yīng)答的核心途徑之一[19]，其缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源的細胞毒性，導(dǎo)致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡[20]。其調(diào)控的下游目標基因包括HO-1氧化還原平衡蛋白，具降低ROS水平[21]和抗炎的功能。Jung等[22]指出 HO-1 的上調(diào)阻止了酒精介導(dǎo)的肝損傷中炎性因子的過量形成而對肝細胞氧化應(yīng)激損傷起到保護作用。Yeligar等[23]研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)HO-1可導(dǎo)致TNF-α水平顯著下降。還有研究表明,誘導(dǎo)HO-1的高表達后,發(fā)揮了直接的抗炎效應(yīng)，使與ALI有關(guān)的TNF-α和IL-6促炎因子表達水平明顯下降，從而緩解了LPS致小鼠的肺組織損害程度[24]。而IL-6是目前已知的可激活HO-1基因轉(zhuǎn)錄的細胞因子之一，因此我們可以大膽假設(shè)，是否通過調(diào)控HO-1導(dǎo)致TNF-α和IL-6炎癥因子的上調(diào)和下調(diào)的表達，構(gòu)成一個新的抗炎途徑參了與酒精性肝病的過程。

本實驗發(fā)現(xiàn)在酒精誘導(dǎo)的肝損傷細胞模型中，TNF-α、IL-6、ALT、AST和MDA的水平顯著上調(diào)，而SOD、Nrf2和HO-1的水平顯著下調(diào)；與模型組相比較，各干預(yù)組的TNF-α、IL-6、ALT、AST和MDA水平明顯降低，SOD、Nrf2和HO-1的水平上升，各干預(yù)組之間的差異大部分無統(tǒng)計學顯著性。以上結(jié)果表明，趕黃草配伍葛花與臨床常用的凱西萊在減輕酒精損傷所致的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肝功能異常等方面效果相當；凱西萊用于改善各類急慢性肝炎、酒精肝的肝功能，但有食欲不振、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀，趕黃草配伍葛花與之相比，副作用少，療效確切，其作用機制可能是通過減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，下調(diào)TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達水平，上調(diào)Nrf2和HO-1的表達水平，進而發(fā)揮保護肝臟的作用有關(guān)。

本方中的葛花為歷來解酒專藥，味甘平、微苦，性微寒,治頭目眩暈、憎寒壯熱,解酒醒脾胃、酒毒酒痢等[25]。趕黃草作為古藺地區(qū)苗族人常用于肝病及醒酒的苗藥，具有清熱解毒和活血散瘀等功效[26]。根據(jù)酒精性肝病臨床表現(xiàn)，古代醫(yī)家將其歸于“酒疸”、“酒癖”等范疇，長期無節(jié)制嗜酒為致病的主因。稟賦不足，脾胃失健，在此基礎(chǔ)上，長期過量飲酒，酒毒濕熱之邪作用于人體，導(dǎo)致肝脾功能失調(diào)是酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。濕熱酒毒瘀滯于體內(nèi)，日久則見肝絡(luò)損傷，出現(xiàn)脅痛苔黃等濕熱引起的癥狀，符合濕熱瘀滯之病變及趕黃草和葛花的用藥指征。因此，通過祛濕熱解酒毒改善肝內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是治療酒精性肝病的重要途徑。二藥合用體現(xiàn)了中藥的相須原則，共奏解酒護肝的作用。本研究為臨床應(yīng)用趕黃草配伍葛花治療酒精性肝病提供了新的理論依據(jù)。

[參 考 文 獻]

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