張冬陽(yáng),郭雪松

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

薏米(CoixchinensisTod.)又稱薏苡仁、薏仁米等,是常見(jiàn)的一種谷物[1],具有清熱、消痛、祛濕、健脾補(bǔ)肺之功效,常作為藥用[2],也是滋補(bǔ)、保健和潤(rùn)膚的佳品[3]。薏米中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及各種微量元素,還含有較多的β-谷甾醇,使其具有抗氧化、抗菌消炎、降低膽固醇、調(diào)節(jié)脂代謝、抗腫瘤等功效[4-6]。

米制品中有關(guān)β-谷甾醇的分離純化及抗氧化作用的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少,洪慶慈等人從燕麥中提取燕麥油,再?gòu)闹刑崛ˇ?谷甾醇放入色拉油中,結(jié)果表明β-谷甾醇具有一定的抗氧化作用[7]。烏汗其木格從裸燕麥麩皮中提取β-谷甾醇,將其放在油脂中進(jìn)行抗氧化測(cè)定,結(jié)果表明,時(shí)間越久,抗氧化作用越強(qiáng);濃度越大,抗氧化作用越大[8]。因此對(duì)于深入了解薏米中β-谷甾醇的抗氧化能力,提高薏米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有重要意義。

β-谷甾醇具有很好的抗氧化活性,然而從米制品中提取β-谷甾醇并進(jìn)行抗氧化性的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用大孔樹脂分離純化薏米中β-谷甾醇的粗提液,通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化,得到最佳純化工藝,以提高β-谷甾醇的提取得率、回收率和純度，為了深入了解β-谷甾醇的生物活性,并進(jìn)一步研究其抗氧化作用,為天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薏米 購(gòu)自錦州市新瑪特超市,粉碎過(guò)60目篩;β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,鄭州鑫瑞化驗(yàn)設(shè)備科技銷售公司;AB-8、D-101、DA-201樹脂 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2苦苯肼 北京索萊寶科技有限公司;鄰二氮菲 北京索萊寶科技有限公司;VC、水楊酸、雙氧水、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、DPPH等其他試劑 均為分析純,購(gòu)自天津貝斯醫(yī)藥科技有限公司。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;FA2004N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提液的制備 參照張冬陽(yáng)的方法進(jìn)行提取[12]。

1.2.2β-谷甾醇分離純化流程 取β-谷甾醇粗提液100 mL→-80 ℃冷凍干燥成粉末→取β-谷甾醇粗品10 g→加175 mL 95%乙醇溶解→過(guò)濾→濾液水洗至中性→大孔樹脂吸附分離→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑→β-谷甾醇純化樣品[9,13]

1.2.3 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析

1.2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 稱取適量的大孔樹脂,用95%的乙醇浸泡24 h,取出大孔樹脂,用蒸餾水洗至無(wú)醇味,用5%的HCl浸泡3 h,用水洗至中性,再用5% NaOH浸泡3 h,水洗至中性[14-16]。

1.2.3.2 大孔樹脂的篩選 準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理后的AB-8、D-101、DA-201三種大孔樹脂各5 g于250 mL錐形瓶中,分別加入40 mL的β-谷甾醇粗提液(濃度0.5 mg/mL),于25 ℃,100 r/min的條件下充分振蕩吸附24 h,過(guò)濾,測(cè)定濃度;在過(guò)濾后的樹脂中加入100 mL水,于25 ℃的條件下恒溫振蕩3 h(100 r/min),過(guò)濾,用濾紙吸干樹脂,加入100 mL 95%的乙醇,于相同條件下洗脫24 h,過(guò)濾,測(cè)定濃度。參照以下公式計(jì)算吸附率(Q1)及解析率(Q2)以及回收率,并以吸附率、解析率為指標(biāo)選擇最佳的大孔樹脂[14,17-18]。

式中:C0-供試液濃度(mg/mL);C1-吸附平衡后濃度(mg/mL);C2-解析液濃度(mg/mL);V1-吸附液體積(mL);V2-解析液體積(mL);m-樹脂質(zhì)量(g)。

1.2.4 薏米中β-谷甾醇純化的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 樹脂質(zhì)量對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 分別稱取1、2、3、4、5 g 處理后的AB-8大孔樹脂,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,測(cè)量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計(jì)算吸附率、回收率。

1.2.4.2 進(jìn)樣濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份處理后的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,然后分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度用75%的乙醇進(jìn)行洗脫,測(cè)量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計(jì)算吸附率、回收率。

1.2.4.3 洗脫劑濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份處理后的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,以1 mL/min的速度進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,分別用15%、35%、55%、75%、95%的乙醇進(jìn)行洗脫,測(cè)量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計(jì)算吸附率、回收率。

1.2.4.4 洗脫速度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 稱取五份預(yù)處理的AB-8大孔樹脂各3 g,采用濕法裝柱,加入0.50 mg/mL的粗提液40 mL,用75%的乙醇進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫,設(shè)置洗脫速度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 mL/min,測(cè)量吸附液中β-谷甾醇的濃度,計(jì)算吸附率、回收率。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇影響樹脂質(zhì)量、進(jìn)樣濃度、洗脫速度,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,對(duì)薏米中β-谷甾醇純化工藝進(jìn)行優(yōu)化,各因素的水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Box-Behnken design experiment factors and levels

AB-8大孔樹脂純化效果的測(cè)定 純度對(duì)比:取上柱前的粗提液和經(jīng)樹脂洗脫后的溶液各50 mL,分別進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并冷凍干燥,各取5 g等質(zhì)量?jī)龈蓸悠?通過(guò)液相色譜測(cè)β-谷甾醇的純度[19],具體條件為:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈(35∶65)、波長(zhǎng):246 nm、柱溫:30 ℃、進(jìn)樣量:10 μL、流速:0.8 mL/min。

按以下公式計(jì)算純度:

式中,m1-粗提液凍干后凍干物的含量mg;m2-洗脫液冷凍干燥后凍干物質(zhì)量mg。

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.7.1β-谷甾醇對(duì)DPPH·清除能力 分別取濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL純化后的樣品溶液2 mL,各加入2 mL的DPPH,參照劉海霞[21]等人的方法。在25 ℃水浴中放置30 min,用95%的乙醇作空白對(duì)照,在517 nm處測(cè)得吸光度為A0,樣品的吸光度為A1。同時(shí)以VC作為對(duì)照,測(cè)不同濃度的吸光度。

式中:A1是2 mL DPPH加2 mLβ-谷甾醇溶液測(cè)得的吸光度;A2是2 mLβ-谷甾醇溶液加2 mL 95%乙醇測(cè)得的吸光度;A0是2 mL DPPH加2 mL 95%乙醇測(cè)得的吸光度。

1.2.7.2β-谷甾醇對(duì)·OH清除能力的研究 參照田瑤[20-21]等人的方法,采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法進(jìn)行測(cè)定。取10 mL試管,依次加入1 mL FeSO4溶液,1 mL 8.8 mmol/L的雙氧水溶液,1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,混勻,于36～37 ℃水浴中反應(yīng)15 min,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度A0。按上述條件,分別加入1 mL不同濃度的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,于36～37 ℃水浴中反應(yīng)15 min,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度Ax。

其中:A0是空白對(duì)照測(cè)得的吸光度;Ax是加入β-谷甾醇溶液測(cè)得的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行數(shù)3次,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,單因素實(shí)驗(yàn)采用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂吸附效果的比較

由圖1可知,AB-8大孔樹脂的吸附率和解析率高于其他兩種樹脂,所以選擇AB-8樹脂作為薏米中β-谷甾醇分離純化的最佳樹脂。

圖1 大孔樹脂吸附效果的比較Fig.1 Comparison of adsorption effect of macroporous resin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 樹脂質(zhì)量對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖2可知,隨著樹脂質(zhì)量的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率先增加后下降,回收率隨著吸附率的增加而變大后趨于穩(wěn)定。當(dāng)樹脂質(zhì)量為3 g時(shí),β-谷甾醇的吸附率和回收率有最大值。當(dāng)樹脂取1～2 g時(shí),由于樹脂質(zhì)量太少,樹脂的吸附能力有限,吸附β-谷甾醇的量偏少,從而導(dǎo)致吸附率和回收率都低[22-23]。當(dāng)樹脂質(zhì)量大于3 g時(shí),由于樹脂達(dá)到吸附平衡,吸附率呈下降趨勢(shì),而回收率趨于穩(wěn)定。所以最佳樹脂質(zhì)量為3 g。

圖2 樹脂質(zhì)量對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.2 Effect of resin mass on the purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.2 進(jìn)樣濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖3可知,上樣濃度從0.1 mg/mL增加到0.3 mg/mL時(shí),吸附率和回收率都呈逐漸上升的趨勢(shì)。當(dāng)上樣濃度為0.5 mg/mL時(shí),薏米中β-谷甾醇的吸附率和回收率均達(dá)到最大值。不斷增大上樣濃度,當(dāng)濃度大于0.5 mg/mL時(shí),吸附率趨于穩(wěn)定,而回收率不斷下降,這是由于進(jìn)樣濃度大于樹脂的吸附飽和度。當(dāng)濃度過(guò)高時(shí),樹脂的再生次數(shù)增加,樹脂使用周期縮短[17,24]。因此最佳上樣濃度為0.5 mg/mL。

圖3 進(jìn)樣濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.3 Effect of injection concentration on the purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.3 洗脫劑濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖4可知,隨著洗脫劑濃度的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率和回收率呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)洗脫劑濃度為15%～75%時(shí),β-谷甾醇的吸附率和回收率逐漸變大,當(dāng)洗脫劑濃度為95%時(shí),兩者變化趨于穩(wěn)定,因?yàn)橐掖紳舛忍邥r(shí),大部分雜質(zhì)也會(huì)被洗脫出來(lái)[17,25-26],也為了節(jié)約成本,因此選擇濃度為75%的乙醇進(jìn)行洗脫。

圖4 洗脫劑濃度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.4 Effect of eluent concentration on purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.2.4 洗脫速度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響 由圖5可知,隨著洗脫速度的增加,薏米中β-谷甾醇的吸附率、回收率都在下降,當(dāng)洗脫速度為1 mL/min時(shí),吸附率和回收率有最大值,當(dāng)洗脫速度大于1 mL/min時(shí),兩者下降速度較為明顯。由于洗脫速度過(guò)低,吸附在樹脂內(nèi)部的β-谷甾醇不能被充分洗脫,而當(dāng)洗脫速度過(guò)快時(shí),有部分β-谷甾醇不能被洗脫出來(lái),使吸附率降低,從而導(dǎo)致回收率降低[26-27]。因此。最佳的洗脫速度為1 mL/min。

圖5 洗脫速度對(duì)薏米中β-谷甾醇純化效果的影響Fig.5 Effect of elution rate on purification of β-sitosterol in Coix chinensis Tod.

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇樹脂質(zhì)量、進(jìn)樣濃度、洗脫速度為考察因素,以β-谷甾醇回收率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化,得到的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到回歸模型的方程為:Y=85.08+3.73A+3.05 B+1.63C-3.02AB+1.87AC-0.31BC-7.13A2-4.09B2-2.65C2。

由方差分析可知,模型p<0.0001,說(shuō)明此回歸方程差異極顯著,失擬項(xiàng)p=0.1547>0.05,差異不顯著。說(shuō)明該方程與實(shí)際情況吻合較好,實(shí)驗(yàn)誤差小。該回歸方程的擬合度是97.41%(R2=0.9741),說(shuō)明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合較好,實(shí)驗(yàn)方法可行。一次項(xiàng)A、B對(duì)回收率的影響極顯著(p<0.01),C對(duì)回收率影響顯著(p<0.05)。交互項(xiàng)AB、AC對(duì)回收率影響顯著(p<0.05),而BC對(duì)回收率影響不顯著(p>0.05)。二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)回收率的影響都極顯著(p<0.01)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVE of regression analysis

2.3.3 回收率的響應(yīng)曲面分析 由圖6可知,隨著進(jìn)樣濃度和樹脂質(zhì)量的增加,回收率先逐漸上升然后平緩下降,響應(yīng)值具有最大值。這是因?yàn)橛行С煞謹(jǐn)U散到樹脂中達(dá)到飽和時(shí),增加上樣濃度,會(huì)使有效成分發(fā)生泄漏,從而使回收率降低[27]。圖的坡度越陡,等高線形狀為橢圓形,表示樹脂質(zhì)量和進(jìn)樣濃度這兩個(gè)因素交互作用顯著[14]。

圖6 樹脂質(zhì)量與進(jìn)樣濃度交互作用圖Fig.6 Interaction between resin mass and injection concentration

由圖7可知,回收率隨著樹脂質(zhì)量的增加先上升后下降,不斷加大洗脫速度,回收率增加的趨勢(shì)較為平緩,因?yàn)闃渲牧坎粔驎r(shí),β-谷甾醇不能被完全洗脫出來(lái),當(dāng)樹脂的量過(guò)多時(shí),大部分雜質(zhì)會(huì)隨之洗脫下來(lái),所以回收率會(huì)降低[27-28]。且圖中等高線的形狀為橢圓形,說(shuō)明兩因素之間的交互作用顯著[14]。

圖7 樹脂質(zhì)量與洗脫速度交互作用圖Fig.7 Interaction between resin quality and elution rate

由圖8可知,隨著進(jìn)樣濃度和洗脫速度的增加,回收率上升的趨勢(shì)緩慢,且等高線為圓形,說(shuō)明這兩個(gè)因素之間交互作用不顯著。

圖8 進(jìn)樣濃度與洗脫速度交互作用圖Fig.8 Interaction between sample concentration and elution speed

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用軟件分析,得到最佳工藝參數(shù)為:樹脂質(zhì)量3.26 g,進(jìn)樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1.19 mL/min，此條件下得到β-谷甾醇回收率的模型預(yù)測(cè)值為86.2707%?？紤]到實(shí)際操作,將其修正為:樹脂質(zhì)量3 g,進(jìn)樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1 mL/min。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的可靠性,在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),得到β-谷甾醇回收率的平均值分別為85.35%、84.34%、85.77%,平均回收率為85.56%,與預(yù)測(cè)值86.2707%比較接近,說(shuō)明該模型回歸方程具有可靠性,可以應(yīng)用于β-谷甾醇純化工藝的研究。

2.4 AB-8大孔樹脂純化效果的測(cè)定

由圖9可知,β-谷甾醇經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后,樣品的純度由原來(lái)的13.8%提高到76.17%。表明實(shí)驗(yàn)精密度較好,工藝條件穩(wěn)定便于控制[28],AB-8樹脂對(duì)β-谷甾醇的純化具有顯著效果。

圖9 純化前后樣品純度的對(duì)比Fig.9 Comparison of purity of samples before and after purification

2.5 抗氧化活性的比較

2.5.1β-谷甾醇對(duì)DPPH·清除能力 由圖10可知,薏米中的β-谷甾醇對(duì)DPPH具有清除能力,且純化后的樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力高于VC和純化前的樣品。當(dāng)濃度為0.1 mg/mL時(shí),VC對(duì)DPPH自由基的清除能力最高,當(dāng)濃度為0.4 mg/mL時(shí),三種溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力幾乎相同,隨著濃度不斷增大,對(duì)DPPH自由基的清除能力都呈不斷上升的趨勢(shì),且經(jīng)過(guò)AB-8樹脂純化后的樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力有顯著提高[28-29]。

圖10 純化前后的樣品與VC對(duì)DPPH清除能力的對(duì)比Fig.10 Comparison of DPPH scavenging ability of samples before and after purification with VC

2.5.2β-谷甾醇對(duì)·OH清除能力的研究 由圖11可知,β-谷甾醇對(duì)于·OH具有一定的清除能力,純化后的樣品清除率最大,高于VC溶液和純化前的樣品。當(dāng)濃度在0.05～0.1 mg/mL范圍內(nèi),VC溶液和純化前的樣品對(duì)·OH的清除能力平緩上升;當(dāng)濃度大于0.2 mg/mL時(shí),兩種樣品的·OH清除率直線上升,后趨于穩(wěn)定。濃度為0.05～0.2 mg/mL時(shí),純化后樣品的清除能力上升幅度較大;當(dāng)濃度大于0.2 mg/mL時(shí),呈緩慢上升趨勢(shì)。由此可見(jiàn),濃度越高,純度越好的樣品對(duì)·OH的清除能力也越大[25,30-31]。

圖11 純化前后的樣品與VC對(duì)·OH清除能力的對(duì)比Fig.11 Comparison of the scavenging ability of ·OH from samples before and after purification

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較三種樹脂的吸附和解析力,將AB-8樹脂作為分離純化最佳的樹脂。在單因素的基礎(chǔ)上,對(duì)樹脂質(zhì)量、進(jìn)樣濃度、洗脫速度三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到最佳工藝條件為:樹脂質(zhì)量3 g,進(jìn)樣濃度0.55 mg/mL,洗脫速度1 mL/min,此條件下得到β-谷甾醇回收率的平均值為85.56%±0.33%,與預(yù)測(cè)值86.2707%比較接近,β-谷甾醇的純度由原來(lái)的13.8%提高到76.17%。將純化前后的樣品做抗氧化研究,表明純度越高,抗氧化能力越大。

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