劉麗萍,吳宏文 ,王勝

(1貴州理工學院食品藥品制造工程學院,貴陽550003;2南昌大學第一附屬醫(yī)院;3貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

臨床上宮頸癌多采取以手術及放化療為主的綜合性治療[1]，因其具有易發(fā)生淋巴轉移、對放療敏感性差以及對化療易耐藥等惡性特征，宮頸癌的治療效果并不理想，預后較差[2]。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)的宮頸癌治療指南認為，順鉑是宮頸癌治療中最有效的單藥化療藥[3]，而獲得性耐藥的產生嚴重制約了順鉑的臨床應用。因此，尋找能夠增強順便化療療效、改善患者預后的有效途徑，是宮頸癌治療領域的研究熱點。茶葉具有防癌抗癌的功效，兒茶素和茶黃素是主要有效成分[4]，其中茶黃素是決定紅茶品質的主要功能成分，約占茶葉干重的0.3%～2%[5]。近年來的研究證實，茶黃素在肝[6]、肺[7]等人體器官中具有抗炎活性。有研究表明，茶黃素可以抑制腫瘤細胞增殖、轉移和擴散[8]，而關于茶黃素對腫瘤細胞(如宮頸癌等)化療敏感性的影響的研究甚少。本研究觀察了茶黃素對宮頸癌細胞株HeLa順鉑化療敏感性的影響，并初步探討其作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器 人宮頸癌HeLa細胞株購自中科院上海細胞庫，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取復蘇后4～10代細胞進行試驗。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素、茶黃素以及順鉑(批號：H37021362)購自齊魯制藥有限公司，MTT溶液購自北京雷根生物技術有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自東莞市華悅科明貿易有限公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，Cleaved Caspase 3 (ab183179)、Cleaved Caspase 9 (ab135544)、PARP (ab4830)、p-IκB (ab107637)、p-NFκB (ab32360)和p-Akt (ab8933)抗體均購自美國Abcam公司，羊抗兔、兔抗鼠二抗購自上海恒遠生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；酶標儀(ELx800)購自美國BioTek公司，凝膠成像儀(GelDoc2000)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 茶黃素對順鉑HeLa細胞半數抑制濃度(IC50)的影響觀察 取對數生長期HeLa細胞，以0.8×104/孔的密度接種于96孔板，細胞貼壁后換成無血清DMEM培養(yǎng)液，撤血清24 h，使細胞周期同步化。設觀察1～9組和對照1～9組，每組3個復孔。對照1～9組細胞分別加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50 μg/mL的順鉑繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察1～9組先加入10 μg/mL的茶黃素，再分別加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50 μg/mL順鉑繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法觀察各組增殖情況：每孔加10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h，棄掉上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩、溶解，于酶標儀上測量490 nm波長吸光度值(OD490)。計算各組細胞存活率，即加藥組吸光度值與未加藥組吸光度值的比值百分比。SPSS13.0統(tǒng)計軟件計算觀察組和對照組HeLa細胞順鉑IC50。

1.3 茶黃素對HeLa細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP及NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達影響觀察 取對數生長期HeLa細胞，以0.8×104/孔的密度接種于96孔板。設對照組、順鉑組、茶黃素組和聯(lián)合組，每組3個復孔。對照組細胞不加藥，順鉑組加入10 μg/mL的順鉑，茶黃素組加入10 μg/mL的茶黃素，聯(lián)合組加入10 μg/mL的順鉑和茶黃素。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用Western blotting法檢測Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白。具體方法為收集各組約1×107個細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1h，TBS-T洗膜，分別加入Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκB、p-NFκB和p-Akt和內參GAPDH的一抗，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔或兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄各條帶灰度值。以目的蛋白與內參照蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 觀察組、對照組HeLa細胞順鉑IC50對照1～9組HeLa細胞存活率分別為102.54%±4.21%、98.32%±2.46%、96.11%±3.64%、90.36%±3.91%、86.29%±3.17%、81.46%±3.61%、78.92%±4.18%、70.63%±4.25%、63.28%±4.21%，HeLa細胞順鉑IC50為25 μg/mL。 觀察1～9組HeLa細胞存活率分別為102.54%±4.21%、80.21%±3.82%、78.92%±4.24%、77.93%±3.95%、68.26%±3.24%、50.36%±4.29%、45.32%±4.74%、40.25%±3.21%、35.37%±3.16%，HeLa細胞順鉑IC50為10 μg/mL。

2.2 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白表達比較 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白相對表達量見表1。順鉑組、茶黃素組、聯(lián)合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，聯(lián)合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于順鉑組、茶黃素組(P均<0.05)。順鉑組、對照組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量相比P>0.05，茶黃素組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于對照組(P均<0.05)，聯(lián)合組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于順鉑組和茶黃素組(P均<0.05)。

表1 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，#P<0.05；與茶黃素組相比，ΔP<0.05。

3 討論

全球每年宮頸癌的新發(fā)病例約50萬，死亡病例約27萬[8,9]。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率居高不下，且有逐年增加的趨勢，患病人群向年輕化發(fā)展，每年宮頸癌的死亡病例數高達5萬。宮頸癌已成為威脅我國女性健康的一大殺手，嚴重影響了女性的生活質量和生命健康[10]。順鉑是一類小分子鉑類抗癌藥，其作用靶點為腫瘤細胞的DNA，能夠引起細胞DNA損傷進而導致細胞凋亡，順鉑的抗癌作用強且抗癌譜廣[11]，而DNA損傷的同時也激活了DNA的修復機制，使順鉑殺傷細胞的能力下降，從而產生藥物的耐藥[12]。此外，順鉑的不良反應多且嚴重，如骨髓抑制、耳腎毒性等[13]，以上因素限制了順鉑的臨床應用。植物素類抗腫瘤藥的抗瘤活性強且不良反應輕微，茶葉中有效成分多酚類化合物(茶多酚)被廣泛用于保健品。體外研究結果表明，茶多酚能夠誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯，但并不影響正常健康細胞[14]。茶黃素是一類能溶于乙酸乙酯的茶多酚，具有多種與人體健康相關的潛在功效，如抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、防治心血管疾病等[15]。近年來關于茶黃素抗癌防癌作用的相關研究結果顯示，茶黃素主要是通過抗氧化、促進腫瘤細胞凋亡等途徑發(fā)揮作用，Prasad等[16]發(fā)現(xiàn)，茶黃素能夠誘導細胞周期蛋白激酶抑制因子p21waf1/cip1表達，抑制細胞周期蛋白B(Cyclin B)表達，進而導致G2/M期阻滯，誘導細胞凋亡。

本研究結果顯示單獨采用順鉑的對照組HeLa細胞順鉑IC50值為25 μg/mL，而聯(lián)合應用10 μg/mL 茶黃素的觀察組HeLa細胞順鉑IC50值降低至10 μg/mL，提示茶黃素增強了HeLa細胞對順鉑的敏感性。

為了研究茶黃素提高HeLa細胞對順鉑的敏感性的機制，本研究進一步觀察了茶黃素對HeLa細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP表達的影響，結果顯示順鉑組、茶黃素組、聯(lián)合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于對照組，聯(lián)合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于順鉑組、茶黃素組。表明茶黃素增強了順鉑誘導HeLa細胞細胞凋亡的能力。

多項研究證實，NF-κB信號通路介導了腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR)的發(fā)生[17, 18]，一般情況下，NF-κB與IκB結合，以無活性狀態(tài)存在于細胞質中；當細胞受到刺激時，IκB發(fā)生磷酸化等級聯(lián)反應，使得NF-κB核易位，調控下游靶基因表達(如MDR1等)[19]。NF-κB和Akt的連續(xù)激活被認為介導了化療藥物耐藥性，阻滯了DDP介導的細胞凋亡[20]。本研究觀察了茶黃素對HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達的影響，結果顯示，順鉑組、對照組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量相比P>0.05，茶黃素組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于對照組(P均<0.05)，聯(lián)合組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于順鉑組和茶黃素組(P均<0.05)。表明順鉑對HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達無明顯影響，但茶黃素可以降低HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達，這可能是茶黃素增強順鉑誘導的HeLa細胞凋亡進而增加HeLa細胞順鉑敏感性的機制。

參考文獻：

[1] Li H, Wu X, Cheng X. Advances in diagnosis and treatment of metastatic cervical cancer[J]. J Gynecol Oncol, 2016,27(4):43.

[2] Karamurzin YS, Kiyokawa T, Parkash V, et al. Gastric-type Endocervical Adenocarcinoma: An Aggressive Tumor With Unusual Metastatic Patterns and Poor Prognosis[J]. Am J Surg Pathol, 2015,39(11):1449-1457.

[3] Hashmi H, Maqbool A, Ahmed S, et al. Concurrent Cisplatin-Based Chemoradiation in Squamous Cell Carcinoma of Cervix[J]. J Coll Physicians Surg Pak, 2016,26(4):302-305.

[4] He HF. Research progress on theaflavins: efficacy, formation, and preparation[J]. Food Nutr Res, 2017,61(1):1344521.

[5] Balentine DA, Wiseman SA, Bouwens LC. The chemistry of tea flavonoids[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 1997,37(8):693-704.

[6] Weerawatanakorn M, Lee YL, Tsai CY, et al. Protective effect of theaflavin-enriched black tea extracts against dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats[J]. Food Funct, 2015,6(6):1832-1840.

[7] Wu Y, Jin F, Wang Y, et al. In vitro and in vivo anti-inflammatory effects of theaflavin-3,3′-digallate on lipopolysaccharide-induced inflammation[J]. Eur J Pharmacol, 2017,79(4):52-60.

[8] Mizuno H, Cho YY, Zhu F, et al. Theaflavin-3, 3′-digallate induces epidermal growth factor receptor downregulation[J]. Mol Carcinog, 2006,45(3):204-212.

[9] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[10] 劉慧強. 我國宮頸癌流行病學特征和高危因素分析[J].中國婦幼保健,2016,31(6):1258-1260.

[11] Boulikas T, Vougiouka M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. (Review)[J]. Oncol Rep, 2003,10(6):1663-1682.

[12] Zhao W, Liu S, Dou Q, et al. The role and mechanism of WEE1 on the cisplatin resistance reversal of the HepG2/DDP human hepatic cancer cell line[J]. Oncol Lett, 2015,10(5):3081-3086.

[13] Wadey RM, Pinches MG, Jones HB, et al. Tissue expression and correlation of a panel of urinary biomarkers following cisplatin-induced kidney injury[J]. Toxicol Pathol, 2014,42(3):591-602.

[14] Beltz LA, Bayer DK, Moss AL, et al. Mechanisms of cancer prevention by green and black tea polyphenols[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2006,6(5):389-406.

[15] 羅奕凡, 禹雙雙, 陳勤操, 等. 茶黃素的生理功效研究進展[J].茶葉通訊,2015,42(4):3-8.

[16] Prasad S, Kaur J, Roy P, et al. Theaflavins induce G2/M arrest by modulating expression of p21waf1/cip1, cdc25C and cyclin B in human prostate carcinoma PC-3 cells[J]. Life Sci, 2007,81(17-18):1323-1331.

[17] Abd ENH, Taylor L, Ayres N, et al. NF-κB decoy polyplexes decrease P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in colorectal cancer cells[J].Cancer Gene Ther,2016,23(5):149-155.

[18] Chen Q, Bian Y, Zeng S. Involvement of AP-1 and NF-κB in the up-regulation of P-gp in vinblastine resistant Caco-2 cells[J].Drug Metab Pharmacokinet,2014,29(2):223-226.

[19] Choi BH, Kim CG, Lim Y, et al. Curcumin down-regulates the multidrug-resistance mdr1b gene by inhibiting the PI3K/Akt/NF kappa B pathway[J]. Cancer Lett, 2008,259(1):111-118.

[20] Garg AK, Jhingran A, Klopp AH, et al. Expression of nuclear transcription factor kappa B in locally advanced human cervical cancer treated with definitive chemoradiation[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2010,78(5):1331-1336.