舒海燕，柯麗娜，陳富超，李斌

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰 442008)

宮頸癌主要與人乳頭瘤病毒(HPV)的致病性密切相關(guān)[1]。HPV是一種結(jié)構(gòu)簡單的DNA病毒，其中的E6和E7基因已被證實是癌基因[2]。E6、E7基因產(chǎn)生的蛋白分別可與抑癌性的p53和pRB蛋白結(jié)合,導(dǎo)致p53和pRB蛋白失活，破壞細(xì)胞的正常周期，最終導(dǎo)致癌變[3]。E6、E7基因是宮頸癌抗腫瘤治療的重要靶點。紫草素是從藥用紫草的根部提取的萘醌類化合物，具有多種生物學(xué)活性[4]，其抗腫瘤作用已得到業(yè)界的廣泛認(rèn)可[5～7]。在宮頸癌方面，有相關(guān)文獻(xiàn)也已報道紫草素可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡[8～10]，但都是從三大經(jīng)典凋亡通路方面進(jìn)行研究，而關(guān)于紫草素能否通過降低HPV E6、E7基因的表達(dá)來達(dá)到治療宮頸癌目的的相關(guān)研究國內(nèi)外未見報道。本研究觀察了紫草素對人宮頸癌細(xì)胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6、E7 mRNA表達(dá)的影響，旨在從抗病毒癌基因表達(dá)方面研究紫草素的抗宮頸癌作用機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 人宮頸癌細(xì)胞株Caski購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。紫草素(Calbiochem公司，純度≥98%)，RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT粉劑(Sigma公司) ，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Antgene公司) ，4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司),一步法核酸提取試劑盒(Hybribio公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國Fermentas公司)，PCR引物(上海生工生物有限公司設(shè)計并合成)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO公司)，SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(TOYOBO公司)。 Synergy型全自動酶標(biāo)板分析儀(Bio-Tek公司)，Molecular Imager ChemiDoc XRS + Image Lab 2. 0型成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司) ，倒置相差顯微鏡，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞測定儀(Becton-Dickinson 公司)， BX51型正置熒光顯微鏡(Olympus公司)，醫(yī)用核酸分子雜交儀(Hybribio公司)，熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000 (Rotor Gene公司)。

1.2 不同濃度紫草素處理的Caski細(xì)胞增殖情況觀察 取對數(shù)生長期Caski細(xì)胞，制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，設(shè)1～6組，每組6孔，次日分別加入含0、5、10、20、40、80 μmol/L紫草素的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h后，采用MTT法觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D490表示)。

1.3 不同濃度紫草素處理的Caski細(xì)胞凋亡率測算 取對數(shù)生長期Caski細(xì)胞，制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，設(shè)A～E組，每組6孔，次日分別加入含0、5、10、20、40 μmol/L紫草素的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集上清液，用PBS清洗后收集清洗液，再用胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，要求細(xì)胞總數(shù)達(dá)1×106個，離心后棄上清，PBS清洗一遍，再用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，每管中分別加入5 μL Annexin V-FITC染色10 min后再加入10 μL PI 染色10min，用流式細(xì)胞儀測算各組細(xì)胞凋亡率。

1.4 不同濃度紫草素處理的Caski細(xì)胞HPV E6、E7 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。細(xì)胞分組及處理同1.3。培養(yǎng)24 h后提取各組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。E6上游引物5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA -3′，E6下游引物5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT -3′，E7 上游 引物5′-GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT -3′，E7下游引物5′-CACTTGCAACAAAACGTTACAATATTG -3′，GAPDH上游引物5′-CTTTGACGCTGGGGCTGGCA -3′，下游引物5′-TGGCAGGGACTCCCCAGCAG -3′。PCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)。采用2-△△CT表示E6、E7 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組Caski細(xì)胞OD490比較 相同培養(yǎng)時間比較1～6組Caski細(xì)胞OD490隨紫草素劑量提高逐漸下降(P均<0.05)。

表1 培養(yǎng)12、24、36 h時1～6組Caski細(xì)胞OD490比較

2.2 各組Caski細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h后A、B、C、D、E組細(xì)胞凋亡率分別為3.9%±0.2%、9.1%±0.3%、28.9%±0.5%、41.7%±1.2%、88.1%±1.3%、97.17%±0.7%。A～E組Caski細(xì)胞凋亡率隨紫草素應(yīng)用劑量提高逐漸升高(P均<0.05)。

2.3 各組Caski細(xì)胞HPV E6、E7mRNA相對表達(dá)量比較 培養(yǎng)24 h后各組Caski細(xì)胞HPV E6、E7 mRNA相對表達(dá)量見表2。培養(yǎng)24 h后A～E組Caski細(xì)胞HPV E6、E7 mRNA相對表達(dá)量隨紫草素應(yīng)用劑量提高逐漸升高(P均<0.05)。

表2 各組Caski細(xì)胞HPV E6、E7 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

作為婦科最常見惡性腫瘤之一，宮頸癌已對女性的健康構(gòu)成極大威脅。目前臨床上治療方式主要有手術(shù)、放療和化療。晚期宮頸癌患者適合全身性綜合治療[11]，化療是全身性綜合治療中的首選方案，盡管迄今為止宮頸癌化療藥物已取得一定的成績，但明確有效的化療藥仍有限，且價格昂貴，耐藥性也越來越大[12]，因此新藥的研發(fā)迫在眉睫。

HPV感染是宮頸癌發(fā)病最主要的原因，其致病機(jī)理主要與其致癌基因E6、E7通過直接或間接的方式干擾細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡，從而促使細(xì)胞永生化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多種藥物通過影響病毒癌基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯來達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的[13]，證實E6、E7是腫瘤治療的重要分子靶點。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡中獨特的細(xì)胞死亡方式，在多種內(nèi)源性基因調(diào)控下，細(xì)胞產(chǎn)生的生理或自然死亡過程是細(xì)胞凋亡[14～16]。細(xì)胞凋亡在維護(hù)機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)、應(yīng)答DNA損傷、抑制細(xì)胞增殖等方面起著重要的作用，也是目前生命科學(xué)研究中的熱門內(nèi)容。目前，細(xì)胞凋亡與腫瘤的治療有極大的相關(guān)性，抗腫瘤藥物的研發(fā)主要集中在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的層面上[17～20]。紫草素作為近年來新發(fā)現(xiàn)的萘醌類化合物，已被證實可從多種途徑抑制多種癌細(xì)胞的凋亡[21]。

本研究結(jié)果顯示紫草素可抑制宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)紫草素作用宮頸癌Caski細(xì)胞后，HPV E6、E7 mRNA表達(dá)量下降，提示紫草素誘導(dǎo)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與降低E6、E7基因的表達(dá)有關(guān)。

HPV感染的治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個難題。紫草素作為傳統(tǒng)中藥的活性成分，在抗菌、抗腫瘤等方面的研究也取得了一定的成果。本研究首次發(fā)現(xiàn)紫草素能誘導(dǎo)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低E6、E7基因的表達(dá)有關(guān)，表明了紫草素在抗HPV相關(guān)宮頸癌的優(yōu)勢，而關(guān)于紫草素能否誘導(dǎo)HPV感染的正常細(xì)胞和癌前病變細(xì)胞凋亡以及降低相關(guān)細(xì)胞E6、E7基因的表達(dá)來發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤的作用，以早期治療HPV感染并預(yù)防宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，仍需進(jìn)一步研究。

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