馬 文，徐勇民，孟 艷，賀 敏，楊小梅，何 明，廖章萍

(1. 南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006；2. 南昌市第三醫(yī)院麻醉科，江西 南昌 330006；3. 南昌市第三醫(yī)院護理部，江西 南昌 330006)

葛根是豆科多年生落葉藤本植物，其干燥根入藥為葛根，是常用中藥，始載于《神農本草經》。葛根素(puerarin，Pue)為其主要有效成分，屬異黃酮類，分子式為C21H20O9，化學名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羥基異黃酮[1]。研究表明，葛根素具有很多藥理作用[2]，包括良好的抗心律失常、抗心肌缺血作用、抗氧化作用、拮抗Ca2+超載、抑制細胞凋亡、降血糖和血脂、減輕炎癥反應、改善心肌收縮、促進微循環(huán)等作用。

臨床上，當心肌出現(xiàn)缺血缺氧時會造成一定的損傷，解決的辦法就是盡快恢復血供，然而供血后非但不能減輕損傷，反而加重細胞功能代謝障礙和結構損傷的現(xiàn)象，即缺血/再灌注 (ischemia/reperfusion, I/R)損傷。近年來，研究發(fā)現(xiàn)[3]，線粒體通透性轉換孔道(mitochondria permeability transition pore, mPTP)與心肌I/R損傷密切相關。mPTP的開放，將引起I/R損傷從可逆向不可逆轉變。因此，要實現(xiàn)有效的心肌保護作用，可通過降低mPTP的開放程度或增加mPTP的關閉來實現(xiàn)。mPTP由多種蛋白構成，是一種非選擇性、高導電性的復合孔道，位于線粒體的內外膜之間，由位于外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)、基質的親環(huán)素D( cyclophilin D, CyP-D)和內膜的腺苷酸轉運酶(adenylate transporter , ANT)等組成[4]。其中VDAC擔任通道開關的角色，調節(jié)mPTP的開放和關閉，控制著離子和代謝物的轉運，進而影響一些生理及病理過程[5]。VDAC有3個亞型，其中VDAC1在哺乳動物線粒體膜上分布最廣、生理作用最關鍵。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮細胞，葛根素可有效抑制鉛介導的mPTP開放及細胞凋亡。本實驗室前期研究表明[7,9]，葛根素可通過上調PKCε蛋白，對抗心肌細胞缺氧/復氧(anoxia/reoxygenation, A/R)損傷，且終濃度為320 μmol·L-1時細胞存活率最高。因此，在此基礎上，我們推測葛根素可能通過影響mPTP開放，從而對抗I/R損傷，發(fā)揮心肌保護作用。本研究擬在心肌細胞建立A/R損傷模型，研究葛根素的心肌保護作用及其與VDAC1/mPTP線粒體通路的關系，闡明葛根素對抗心肌I/R損傷的分子生物學機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 大鼠H9c2心肌細胞株，購自中國科學院細胞庫。

1.1.2藥品與試劑 葛根素購自中國藥品生物制品檢定所；特級胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自WISENT公司；高糖(dulbecco’s modified of eagle’s medium, DMEM)培養(yǎng)基購自Solarbio公司；TransZol購自北京全式金生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；Real-time PCR試劑盒購自德國QIAGEN生物公司；Anti-VDAC1(ab15895)和Anti-beita Actin(ab6276)購自Abcam公司；二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L) (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) , ZB-2301)，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L) (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L), ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Lipofectamine 2000TM脂質體購自Invitrogen公司；線粒體提取試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，購自江蘇凱基生物科技公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其余化學試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器 FormaTM310 直熱式 CO2培養(yǎng)箱、全波長酶標儀、三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈化工作臺(蘇州凈化設備)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國Beckman公司)；5804-R低溫高速離心機(德國Eppendorf)； DYY-Ⅱ型穩(wěn)壓電源(北京六一儀器廠)。

1.2H9c2心肌細胞的培養(yǎng)H9c2心肌細胞接種于無菌的細胞培養(yǎng)板，含10% FBS的高糖培養(yǎng)基提供營養(yǎng)，置于含5% CO2，37℃恒溫、濕度飽和的清潔無菌孵箱中培養(yǎng)。

1.3H9c2心肌細胞A/R模型的建立心肌細胞生長至接近融合狀態(tài)時，棄培養(yǎng)基，換用模擬缺氧缺糖溶液(pH=6.8，NaH2PO40.9 mmol·L-1、KCl 10.0 mmol·L-1、Hepes 20.0 mmol·L-1、NaHCO36.0 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 mmol·L-1、乳酸鈉40.0 mmol·L-1、CaCl21.0 mmol·L-1、NaCl 98.5 mmol·L-1)，置于密閉性良好的A/R裝置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再換用模擬再灌注溶液(pH=7.4，NaH2PO40.9 mmol·L-1、KCl 5.0 mmol·L-1、NaHCO320.0 mmol·L-1、CaCl21.0 mmol·L-1、Hepes 20.0 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 mmol·L-1、Glu·H2O 1.2 mmol·L-1、NaCl 129.5 mmol·L-1)，復氧孵育2 h[9]，并通過檢測LDH和CK來確定模型的構建是否成功。

1.4VDAC1真核表達載體pFLAG-VDAC1在H9c2心肌細胞中的表達參照本實驗室已建立方法，構建pFLAG-VDAC1質粒[9]，構建完成后，以空載質粒pFLAG為對照，進行重組質粒表達效率的檢測，隨后擴增、提取、純化、轉染至H9c2心肌細胞中。轉染之前，棄去培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基漂洗細胞2次，換上新鮮的無抗生素、無血清的培養(yǎng)基，將質粒用Lipofectamine 2000TM脂質體轉染至心肌細胞中，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，裂解細胞，提取RNA和蛋白，利用Real-time PCR和Western blot分別檢測VDAC1 mRNA和蛋白的表達水平。

1.5實驗分組實驗共分4組：① Control組，正常培養(yǎng)不做處理；② A/R組，棄去培養(yǎng)基換用缺氧缺糖溶液，置于密閉裝置中，通入含95% N2、5% CO2的混合氣體缺氧孵育3 h；然后棄缺氧缺糖溶液，換用再灌注溶液，通入含95% O2、5% CO2的混合氣體復氧孵育2 h；③ 葛根素組，加葛根素320 μmol·L-1孵育[9]，24 h后處理同A/R組；④ pFLAG-VDAC1-葛根素組，將重組質粒pFLAG-VDAC1轉染至H9c2細胞中，24 h后處理同葛根素組。每組重復5次。

1.6生化指標檢測建模結束后，收集各組復氧液500 μL，根據(jù)試劑盒說明書檢測LDH、CK活性。

1.7VDAC1真核表達載體pFLAG-VDAC1轉染效率的檢測以空載質粒載體pFLAG為對照，將重組質粒 pFLAG-VDAC1 轉染至H9c2細胞48 h后，裂解細胞，提取蛋白，Western blot檢測VDAC1蛋白表達。

1.8RNA提取和實時定量PCR(Real-timePCR)檢測[8]采用TransZol試劑盒，提取各實驗組細胞總RNA，使用逆轉錄酶合成cDNA，逆轉成2 μg體系。實時熒光定量PCR儀進行擴增，使用Real-time PCR試劑盒按下列循環(huán)條件進行40個循環(huán)：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，10 s。VDAC1引物：上游5′-GACTGCTGTCAATCTCGCCT-3′，下游5′-GGAGTTGTTCACTTTGGCCG-3′；β-actin引物：上游5′-ATGACGATATCGCTGCGCTC-3′，下游5′-CAGTTGGTGACAATGCCGTG-3′。

1.9Westernblot檢測H9c2心肌細胞VDAC1蛋白造模結束后，提取各組H9c2細胞總蛋白，取適量的蛋白提取液，利用BCA法進行濃度測定，定量上樣蛋白總量，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，12%分離膠)，電泳結束后濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，4℃過夜孵育VDAC1、β-actin的一抗。洗膜液洗去未結合的一抗，后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖床孵育2 h，ECL化學發(fā)光法檢測。以β-actin為內參，標化相應組VDAC1的蛋白條帶密度。

1.10mPTP開放檢測采用線粒體提取試劑盒，提取各組H9c2心肌細胞線粒體，通過線粒體腫脹實驗檢測mPTP的開放[10]。使用CaCl2誘導劑后，mPTP開放程度增加，則線粒體通透性逐漸增大，最終導致線粒體腫脹甚至破裂，此時吸光度明顯下降。在520nm波長處，測各組吸光度初值(OD1)，記錄此時數(shù)值，隨后各實驗組加200 μmol·L-1CaCl2誘導劑，每分鐘檢測1次吸光度，直到約20 min后吸光度不再變化，記錄此時吸光度值(OD2)，△OD=OD1-OD2。用△OD/min×1 000表示mPTP開放程度，此數(shù)值越大，表示mPTP開放程度越大。

1.11AnnexinV-FITC和PI雙染色法檢測H9c2心肌細胞凋亡Annexin V是分子量約為36 ku的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，當細胞受損發(fā)生早期凋亡時，磷脂酰絲氨酸由膜內移到膜外，Annexin V則可與之結合。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種DNA熒光染料，不能透過細胞膜，當細胞受損或壞死時細胞膜被破壞，PI透入胞核并嵌入雙鏈DNA中發(fā)出紅色熒光。將Annexin V用熒光素FITC標記，發(fā)出綠色熒光，以標記的Annexin V作為熒光探針。因此，常用Annexin V-FITC和PI雙染色法區(qū)分不同凋亡時期的細胞。正常細胞：Annexin V(-)，PI(-)；凋亡中、晚期或壞死細胞：Annexin V(+)，PI(+)；早期凋亡細胞：Annexin V(+)，PI(-)。各組細胞用冷的1×PBS清洗2次，吸盡1×PBS，加入適量不含EDTA的胰酶消化細胞，用無血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細胞；再用冷的1×PBS洗滌細胞2次，加入500 μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞，另加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混勻后避光孵育15 min；最后加入5 μL PI染色液，混勻后避光孵育10 min，立即用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1葛根素對A/R損傷后LDH、CK活性的影響當心肌細胞損傷時，LDH和CK由胞內釋放到胞外。如Fig 1所示，與Control組相比，H9c2心肌細胞經A/R處理后，LDH、CK活性均明顯提高(P<0.05)，說明A/R模型構建成功；葛根素預處理組LDH、CK活性降低，但轉染pFLAG-VDAC1重組質粒后，則可取消葛根素的保護作用。

Fig 1 Effect of puerarin treatment on LDH and CK activity in H9c2 subjected to A/R n=5)

C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsA/R group;△P<0.05vsPue+A/R group.

2.2重組質粒pFLAG-VDAC1表達效率的檢測如Fig 2所示，空載質粒pFLAG組VDAC1蛋白水平與Control組相比，無明顯改變，而pFLAG-VDAC1組VDAC1蛋白水平明顯提高，說明重組質粒轉染成功，并有效表達。

Fig 2 Western blot analysis of VDAC1 in H9c2 cells transfected with VDAC1 recombinant vector n=5)

C: Control group; pF: pFLAG group; pF-V: pFLAG-VDAC1 group.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vspF group.

2.3葛根素對VDAC1mRNA表達的影響由Fig 3可知，與Control組相比，A/R組VDAC1 mRNA水平明顯上調；葛根素預處理24 h可明顯抑制VDAC1 mRNA的上調。

Fig 3 Real-time PCR analysis of VDAC1 mRNA expression in H9c2 subjected to A/R n=5)

C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group.▲P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsA/R group;#P<0.05vsPue+A/R.

2.4葛根素對心肌細胞VDAC1蛋白表達的影響Fig 4的Western blot結果顯示，A/R組VDAC1表達明顯上調；葛根素預處理組的VDAC1表達水平較A/R組明顯下調(P<0.05)。

Fig 4 Effect of puerarin treatment on the expression of VDAC1 in H9c2 cells exposed to A/R n=5)

C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsA/R group;△P<0.05vsPue+A/R group.

2.5葛根素對mPTP開放的影響當mPTP開放時，線粒體通透性增高，用200 μmol·L-1CaCl2處理后，則進入線粒體而導致線粒體腫脹。如Fig 5所示，A/R組A520急劇下降，但葛根素預處理組則緩慢下降，△OD/min值較A/R組明顯減小(P<0.05)，說明mPTP開放受到抑制。而在pFLAG-VDAC1-葛根素組，線粒體A520變化與A/R組差異無統(tǒng)計學意義。

Fig 5 Effect of puerarin treatment on mPTP opening in H9c2 subjected to A/R n=5)

A: Original traces were shown for Ca2+-dependent mitochondrial swelling, monitored by the decrease in absorbance at 520 nm; B: Rate of mitochondrial swelling induced by 200 μmol·L-1CaCl2. Data were shown as a change of A520(△D/min).*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPue+A/R group;△P<0.05vsA/R group.

2.6葛根素對A/R損傷后心肌細胞凋亡的影響如Fig 6所示，H9c2心肌細胞經A/R處理后，與Control組比較，細胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.05)；葛根素預處理組細胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05)；pFLAG-VDAC1-葛根素組細胞凋亡數(shù)增高，說明上調VDAC1表達可取消葛根素的保護作用。

3 討論

葛根素抗A/R損傷的作用已有研究[11-12]，其可通過調節(jié)PKCε蛋白、Bcl-2、Bax蛋白的表達發(fā)揮抗損傷作用。本文首次研究VDAC1與葛根素抗A/R損傷作用之間的關系，及其可能的分子機制。

Fig 6 Puerarin preconditioning could inhibited the apoptosis of cardiomyocytes suffered n=5)

A: Representative flow cytometric dot plots (x-axis: Annexin V staining, y-axis: PI staining); B: Quantification of apoptotic cells population.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsA/R group;#P<0.05vsPue+A/R group.

mPTP是位于線粒體跨膜的非特異性孔道，正常情況處于關閉狀態(tài)，是維持線粒體結構完整，實現(xiàn)其生理功能的必要條件。缺血期，Na+/K+-ATP酶失效，鈉鈣離子交換受阻，使得鈣離子超載，線粒體氧化磷酸化抑制，ATP合成減少，乳酸堆積，導致細胞內的pH降低，mPTP處于關閉狀態(tài)；再灌注期，恢復有氧呼吸，ATP合成增加，鈣超載加重，活性氧大爆發(fā)，導致線粒體上mPTP不可逆開放[13]。mPTP開放將引起線粒體膜電位降低，直至崩潰，又由于基質腫脹和內膜伸展，隨后引起外膜破裂，促凋亡因子由線粒體釋放到胞質，激活下游凋亡蛋白，最終誘導細胞凋亡或壞死。因此，抑制mPTP的開放，可有效地抑制細胞凋亡或壞死，從而發(fā)揮抗損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，A/R損傷后，mPTP開放，細胞凋亡明顯增加；葛根素預處理后mPTP開放得到抑制，細胞凋亡減少，VDAC1高表達組則可取消葛根素抑制mPTP開放的作用，可認為葛根素通過抑制或者部分抑制mPTP開放來減少細胞凋亡。

VDAC1參與調控線粒體外膜通透性，控制離子和代謝物進出細胞，影響細胞凋亡；同時VDAC1也是Bcl-2家族的重要結合位點，它可與Bax/Bak相互作用形成孔徑增大的孔道，使線粒體內的凋亡相關蛋白如細胞色素C等進入胞質，激活caspase-3，啟動細胞凋亡的程序[15]。當細胞中VDAC1蛋白過表達時，會導致VDAC1由單體狀態(tài)向多聚體狀態(tài)發(fā)生轉變，釋放促凋亡蛋白到胞質，誘導細胞凋亡[14-15]。本研究結果表明，H9c2心肌細胞經A/R損傷后，VDAC1基因和蛋白水平均明顯上調，細胞凋亡水平較高；葛根素預處理則可下調VDAC1的表達，細胞凋亡水平較低；而導入pFLAG-VDAC1質粒，上調VDAC1表達后，細胞凋亡水平較高，則說明取消了葛根素的保護作用，葛根素可能通過影響VDAC1的表達發(fā)揮抗A/R損傷的作用。

綜上所述，我們推斷，葛根素抗A/R損傷作用與VDAC1/mPTP機制密切相關。其通過下調VDAC1的表達，防止mPTP的過度開放，從而發(fā)揮保護作用。葛根素作為心血管保護藥物，其可能涉及的分子機制還有待于進一步研究。

(致謝：本實驗研究主要在南昌大學醫(yī)學部江西省藥理學重點實驗室完成，感謝實驗室人員的指導和幫助！)

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