鄧艷輝，公文艷，李 強(qiáng)，伍飛臻，段萍萍, 黃河清

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510630；2. 中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)作為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，目前認(rèn)為是一種慢性炎癥、增殖反應(yīng)性疾病[1]，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的最常見原因。DN病變機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1, SphK1) 信號(hào)通路與DN的關(guān)系近年來已成為研究的熱點(diǎn)，SphK1是細(xì)胞生物學(xué)功能的重要調(diào)控分子，在腎間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[2]。研究表明，長期高血糖、糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等均可激活SphK1，從而介導(dǎo)一系列炎癥、增殖反應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。糖尿病狀態(tài)下，SphK1活性增強(qiáng)，不但誘使腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖，還可進(jìn)一步激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等核轉(zhuǎn)錄因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中纖維連接蛋白(fibronectin, FN)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transformation growth factor β1，TGF-β1)等纖維化成分明顯增加[4-6]。說明DN早期已存在SphK1信號(hào)通路的激活。因此，抑制SphK1信號(hào)通路，可能成為防治DN發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要靶標(biāo)。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是我國傳統(tǒng)治療消渴病癥(糖尿病及其慢性并發(fā)癥)的中藥虎杖中提取的一種二苯乙烯類化合物，是虎杖的主要活性成分，由于其功效獨(dú)特、明顯而副作用小，已廣泛用于人類的生活保健之中。近年來的研究表明[7-9]，白藜蘆醇具有抗DN的作用，但目前確切的分子作用機(jī)制尚不明確。最新研究顯示[10-11]，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)SphK1活性、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。那么，白藜蘆醇抗DN的作用是否與SphK1及下游核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)呢？目前尚未見到從影響SphK1/AP-1信號(hào)通路研究白藜蘆醇抗DN作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究采用高糖誘導(dǎo)的GMC模型，觀察白藜蘆醇對(duì)模型細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)的成分FN、TGF-β1表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究其對(duì)SphK1/AP-1信號(hào)通路的影響，以探討白藜蘆醇抑制GMC增殖、抗DN的確切分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC中國武漢大學(xué)) 。

1.1.2藥物與試劑 白藜蘆醇購自北京偉業(yè)科創(chuàng)科技有限公司；SphK1抑制劑(SK-Ⅱ)，購自Merck-Millipore;D-(+)-葡萄糖、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO) 、噻唑藍(lán)(MTT)、α-tubulin抗體，均購自Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；FN一抗購自Santa Cruz Biotechnology; TGF-β1、SphK1一抗購自Cell Signaling Technolosy公司;辣根過氧化物酶偶合的兔、鼠二抗購自Promega公司; AP-1探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EMSA試劑盒購自Invitrogen公司；核蛋白提取試劑盒購自Active motif公司。

1.1.3儀器 雙人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Elx-800型酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的傳代與培養(yǎng) HBZY-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度5% CO2。每2～3 d用含0.03% EDTA的胰酶消化傳代，傳代后第3～12代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。消化重懸的GMC稀釋成相應(yīng)的密度，接種至培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長近融合時(shí)，用無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再給予不同濃度的藥物預(yù)處理2 h后，加入含高糖培養(yǎng)基刺激24 h后，收集細(xì)胞。

1.2.2MTT法檢測白藜蘆醇對(duì)GMC細(xì)胞活力及增殖的影響 GMC活力可反映GMC增殖的變化情況。以104/孔的密度將GMC細(xì)胞接種于96孔板中，按上述方法處理后，加入5、10、20 μmol·L-13個(gè)不同濃度的藥物，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。GMC培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加20 μL MTT工作液( 5 g·L-1) ，繼續(xù)于37℃溫箱培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO溶液，振蕩混勻10 min，選擇570 nm波長，在多功能酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度值OD570nm，可間接反映GMC細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.2.3Western blot法檢測GMC細(xì)胞中FN、TGF-β1、SphK1蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞終止培養(yǎng)后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用冷PBS漂洗細(xì)胞2次，吸凈PBS，加入去污裂解液，冰上用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，收集裂解液至1.5 mL EP管，冰上靜置30 min后，離心取上清，用BCA法測定蛋白含量。經(jīng)5%濃縮膠、8%分離膠SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，每孔上樣20 μg總蛋白。用電轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)后，TBST洗膜3次，每次5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，F(xiàn)N一抗( 1 ∶500) 、TGF-β1一抗( 1 ∶1 000) 、SphK1一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，次日洗膜后，分別用對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000) 室溫孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光劑顯影。利用圖像分析軟件Quantity One對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.4EMSA法測定GMC細(xì)胞中AP-1的活性 GMC處理結(jié)束后, 用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，Braford方法測定蛋白質(zhì)濃度后用于EMSA。生物素標(biāo)記的AP-1探針序列如下:正向5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3'; 反向 3'-GCGAACTACTGA GTCGGCCTT-5'。加入探針之前，將5 μg核蛋白與其他組分[50 mg·L-1poly(dI-dC)、0.05% NP-40、5 mmol·L-1MgCl2、2.5%甘油預(yù)先室溫孵育10 min；加入2.0 μL AP-1標(biāo)記探針，室溫孵育20 min；反應(yīng)體系中加入2.5 μL 5×loading buffer (總共15 μL體系)。7%非變性SDS-PAGE凝膠電泳之后，電轉(zhuǎn)至尼龍膜，紫外交聯(lián)10 min；封閉液室溫封閉1 h后，加入穩(wěn)定的鏈親和素-辣根過氧化物酶交聯(lián)物(1 ∶300)，與探針進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)后，曝光，顯影。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇呈濃度依賴性地抑制GMC細(xì)胞增殖如Fig 1所示，與正常培養(yǎng)的GMC(含5.6 mmol·L-1glucose, NG)相比，高糖培養(yǎng)24 h的GMC(含30 mmol·L-1glucose,HG)可明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P<0.05)，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[12]。用不同濃度的白藜蘆醇對(duì)未加高糖刺激的正常培養(yǎng)的GMC干預(yù)24 h后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)正常培養(yǎng)的GMC無明顯影響，說明本實(shí)驗(yàn)中選用的5、10、20 μmol·L-1濃度的白藜蘆醇對(duì)GMC沒有毒性。與高糖培養(yǎng)的GMC相比，不同濃度的白藜蘆醇預(yù)處理2 h后，再與高糖同處理24 h，可濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的GMC增殖(P<0.05)，其中20 μmol·L-1濃度抑制效應(yīng)最佳。

2.2白藜蘆醇調(diào)節(jié)SphK1信號(hào)通路對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠GMC中FN、TGF-β1表達(dá)的影響

2.2.1白藜蘆醇呈濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的GMC中FN、TGF-β1、SphK1的表達(dá) 如Fig 2所示, 與正常組相比，高糖刺激24 h可明顯誘導(dǎo)GMC細(xì)胞中FN、TGF-β1、SphK1蛋白表達(dá)上調(diào)，不同濃度的白藜蘆醇對(duì)高糖刺激的GMC中FN、TGF-β1、SphK1的蛋白表達(dá)均有抑制作用，且呈濃度依賴性。說明白藜蘆醇可通過下調(diào)FN、TGF-β1、SphK1蛋白的表達(dá)，抑制GMC增殖。

2.2.2白藜蘆醇抑制SphK1信號(hào)通路激活而降低FN、TGF-β1的表達(dá) 通過Fig 2的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)濃度為20 μmol·L-1的白藜蘆醇可明顯下調(diào)FN、TGF-β1、SphK1蛋白的表達(dá)，為探討其下調(diào)與SphK1信號(hào)通路的關(guān)系，我們進(jìn)一步用SphK1抑制劑SK-Ⅱ(10 μmol·L-1)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)SK-II也能明顯抑制這些蛋白的表達(dá)(Fig 3)。說明白藜蘆醇可能通過抑制SphK1信號(hào)通路，下調(diào)FN、TGF-β1的表達(dá)，從而達(dá)到抑制GMC增殖的目的。

2.3白藜蘆醇可抑制AP-1的DNA結(jié)合活性與正常對(duì)照組相比，高糖刺激0.5 h即能明顯增加AP-1的DNA結(jié)合活性，白藜蘆醇和SphK1抑制劑SK-Ⅱ(10 μmol·L-1)預(yù)處理2 h均能明顯降低AP-1的DNA結(jié)合活性(Fig 4)。提示白藜蘆醇抑制FN、TGF-β1、SphK1表達(dá)的作用可能與其抑制核轉(zhuǎn)錄因子AP-1活化有關(guān)。

Fig 1 Resveratrol inhibited high glucose-induced mesangial cell proliferation by MTT

#P<0.05vsNG;*P<0.05vsHG

Fig 2 Effects of resveratrol on FN, TGF-β1 and SphK1 protein expression in high glucose- induced mesangial

GMC was pretreated with different resveratrol for 2 h, and then stimulated by high glucose for further 24 h.#P<0.05vsNG;*P<0.05vsHG.

Fig 3 Effects of resveratrol on FN and TGF-β1 protein expression by inhibition of SphK1

GMC was pretreated with 20 μmol·L-1resveratrol or SK-Ⅱ for 2 h, and then stimulated by high glucose.#P<0.05vsNG;*P<0.05vsHG.

Fig 4 Effects of resveratrol on high glucose-induced activation of AP-1 in GMC

GMC was pretreated with resveratrol or SphK1 inhibitor Ⅱ (SK-Ⅱ) at the indicated concentrations for 2 h, followed by addition of high glucose for half an hour. Nuclear extracts were subjected to EMSA to examine AP-1 DNA binding activity.

3 討論

大量研究表明，高血糖引起的GMC增殖及伴隨發(fā)生的ECM積聚是糖尿病腎損害中早期最主要的病理改變，其過度增殖及纖維化在DN的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[13-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇高糖培養(yǎng)GMC，模擬DN時(shí)體內(nèi)的高血糖環(huán)境，而GMC長期暴露于高糖環(huán)境中，SphK1信號(hào)通路會(huì)被激活，從而促進(jìn)下游核轉(zhuǎn)錄因子AP-1等的活化，進(jìn)而影響AP-1調(diào)控的相關(guān)蛋白的表達(dá)[4,6]。包括影響GMC增殖及纖維化的主要成分FN，因其具有可同時(shí)與ECM各類成分相結(jié)合、并促進(jìn)ECM其他成分沉積的特點(diǎn)，常被作為評(píng)價(jià)ECM積聚程度、腎臟纖維化的一個(gè)重要指標(biāo)。TGF-β1被認(rèn)為是慢性腎臟纖維化過程中最重要的樞紐性細(xì)胞因子，很多發(fā)病機(jī)制如氧化應(yīng)激損傷都可以通過TGF-β1實(shí)現(xiàn)最終的硬化結(jié)局。另外，F(xiàn)N、TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)域有AP-1的結(jié)合位點(diǎn)，SphK1第一內(nèi)含子有AP-1的作用元件。因此，在本研究中，我們選擇SphK1/AP-1信號(hào)通路，探討其對(duì)高糖培養(yǎng)的GMC細(xì)胞增殖的影響。白藜蘆醇抗DN的作用被認(rèn)為是多方面因素的結(jié)果，關(guān)于其與SphK1信號(hào)通路關(guān)系的研究，目前主要集中在抗腫瘤方面[7, 15]，而其抗DN作用是否也與該通路有關(guān)尚無報(bào)道。因此，我們在文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇的部分效應(yīng)與其抗炎癥損傷、抗氧化應(yīng)激相關(guān)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了白藜蘆醇的上述效應(yīng)與調(diào)節(jié)SphK1/AP-1信號(hào)通路的關(guān)系。

我們的研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下，GMC增殖較正常情況下明顯增加，細(xì)胞內(nèi)FN、TGF-β1、SphK1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的DNA結(jié)合活性也明顯增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[4,6]。而使用白藜蘆醇和SphK1抑制劑干預(yù)后的GMC可明顯扭轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，白藜蘆醇呈濃度依賴性地抑制GMC增殖，并降低高糖誘導(dǎo)的GMC中FN、TGF-β1、SphK1的高表達(dá)，同時(shí)抑制AP-1的活化；SphK1抑制劑也能明顯降低FN、TGF-β1的表達(dá)、抑制AP-1的活化，提示白藜蘆醇的上述作用機(jī)制可能與抑制SphK1/AP-1信號(hào)通路密切相關(guān)。研究結(jié)果為白藜蘆醇防治DN提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。那么，其是否同樣影響關(guān)鍵酶SphK1催化生成的S1P及其受體的表達(dá)活性等，有待我們進(jìn)一步完善相關(guān)研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的所有人員表示衷心的感謝！)

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