王思雨，熊 靜，周 宏，羅興燕，劉 陽，賴 翼

(成都醫(yī)學院1.科研實驗中心、2. 檢驗醫(yī)學院，四川 成都 610500)

T細胞在機體特異性免疫應答中發(fā)揮著重要作用。T細胞正常的活化增殖是機體免疫應答的關鍵，但是T細胞的異常活化增殖，可能導致器官移植排斥反應，以及類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結腸炎、腎病綜合征等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[1-3]。目前臨床治療此類疾病的方案常為免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A、環(huán)磷酰胺、貝拉西普、他克莫司(tacrolimus, FK506)和雷帕霉素(rapamycin, RAPA)。免疫抑制劑對T細胞異?；罨鲋尘哂幸种谱饔?，能有效緩解病情，減輕患者的痛苦[4]。但是，不同患者的藥物敏感性存在明顯個體差異，治療過程中發(fā)現(xiàn)單一療法效果不明顯時，還需給予聯(lián)合、輪換或序貫治療。繼續(xù)探索疾病的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點和全新結構的先導化合物，將為患者提供更多的選擇與希望。

苯并惡唑是一類非常重要的含氮雜環(huán)化合物，它們衍生的化合物往往具有極高生物活性及藥理活性，因此在醫(yī)藥和農(nóng)藥領域有著重要的作用。在醫(yī)藥方面,苯并惡唑類化合物因具有消炎止痛、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、抗HIV[7]活性而被制成新型藥劑。通過T細胞增殖抑制活性篩選平臺，對小分子化合物進行細胞水平高通量篩選，發(fā)現(xiàn)苯并惡唑衍生物2-(苯并惡唑基-2基)-4,5,6,7-四氫-2氫-吲唑-3-醇[2-(benzo[d]oxazol-2-yl)-4,5,6,7- tetrahydro-2H-indazol-3-ol，PO-291]對T細胞增殖具有明顯的抑制作用,其結構見Fig 1。本實驗對PO-291的作用機制進行初步的探索，為進一步開發(fā)療效好、毒性小的新型免疫抑制劑提供思路。

Fig 1 Chemical structure of PO-291

1 材料

1.1試劑苯并惡唑衍生物PO-291購自美國Chembridge公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS液，購自美國Gibco公司；FK506、雷帕霉素、碘化丙啶(propidium iodide, PI)購自美國Sigma-Aldrich公司；LY294002、AG-490購自美國Promega公司；抗人CD3/CD28 Functional Grade Purified(Anti-CD3/CD28 mAbs)、抗人CD3-PE-cy、抗人CD25-PE-cy、抗人CD69-APC、人細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17，以及IFN-γ酶聯(lián)檢測試劑盒，均購自美國eBio-science公司；5-羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)，購自美國Invitrogren公司；人T細胞MACS磁珠分離試劑盒，購自德國Miltenyl Biotec公司；人淋巴細胞分離液，購自挪威Axis-Shield POC公司；細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒，購自南京凱基生物公司；p-STAT5、STAT5，p-p70S6K、p70S6K，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2儀器Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司)；Ⅱ級A2型生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、小型臺式離心機(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；全自動化學發(fā)光系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1分離和純化人T細胞根據(jù)先前的報道[8]分離人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。PBMCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。使用人T細胞MACS磁珠分離試劑盒陰性分選出T細胞。分選后，通過流式細胞儀結合PE-anti-CD3染色對T細胞進行檢測。此時T細胞純度已達到95%，可用于后續(xù)實驗。

2.2CFSE標記分析根據(jù)先前文獻所描述的方法[9]，采用5-羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)結合流式細胞術檢測細胞的增殖情況。在37℃條件下，使用濃度為2.5 μmol·L-1的CFSE對人靜息的T細胞(109cells·L-1)、活化的T細胞(109cells·L-1)和PBMCs (109cells·L-1)進行10 min的染色，經(jīng)PBS清洗2次后，重懸于含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。將被標記的靜息T細胞，加入預先包被好抗CD3抗體 (2 mg·L-1)并含可溶性抗CD28 抗體(1 mg·L-1)的微孔板進行活化。再加入IL-2(10 μg·L-1)對被標記的活化T細胞進行誘導。采用源自另一人經(jīng)過3 000 rad輻照的等同數(shù)量的PBMCs對被標記的PBMCs進行活化。在與不同濃度的PO-291共同培養(yǎng)72 h后，通過流式細胞術檢測分別由anti-CD3/anti-CD28、IL-2和異體抗原活化的T細胞的增殖情況。不活化且不加藥物的T細胞作為陰性對照(0%)，活化而不加藥物的T細胞作為陽性對照(100%)。

2.3細胞凋亡分析采用Annexin V 和PI雙染試劑盒檢測PO-291對活化T細胞凋亡的影響。PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、雷帕霉素(RAPA 0.1 μmol·L-1)作用于經(jīng)抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T細胞(109cells·L-1) 24或48 h后。收集并清洗細胞，通過流式細胞術對細胞凋亡情況進行分析。

2.4細胞活力分析PI染色檢測細胞增殖活性。采用不同濃度PO-291 (0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)處理人的靜息T細胞(109cells·L-1)和PBMC (109cells·L-1) 72 h。使用流式細胞術結合PI染色對細胞活力進行分析。

2.5CD25和CD69的表達PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、FK506 (0.1 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T細胞(109cells·L-1)24 h后，收集細胞。并在4℃條件下，采用PE-anti-CD25 和APC-anti-CD69對T細胞染色30 min，PBS清洗細胞，通過流式細胞術分析T細胞CD25和CD69的表達。

2.6細胞周期分析PO-291(0、5、10、20 μmol·L-1)、RAPA(0.1 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T細胞(109cells·L-1)72 h(加藥不活化的細胞作為對照組)。收集細胞，根據(jù)Cycle test Plus DNA試劑盒說明書對細胞進行處理，采用流式細胞術對細胞進行分析。

2.7細胞因子酶聯(lián)免疫吸附分析不同濃度PO-291(0、5、10、20 μmol·L-1)、FK506 (0.1 μmol·L-1)、LY-294002(50 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28(1 mg·L-1)活化的T細胞(109cells·L-1)24或48 h。收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書，對細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ的分泌水平進行分析。

2.8蛋白免疫印跡分析T細胞經(jīng)抗CD3(2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化72 h后，清洗并單獨培養(yǎng)6 h。使用不同濃度PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、AG-490 (50 μmol·L-1)、RAPA (0.1 μmol·L-1)再培養(yǎng)T細胞6 h后，加入IL-2刺激細胞30 min。隨后向細胞懸液中加入細胞裂解液，離心并分離出上清液。細胞裂解出的蛋白質(zhì)(20 μg)在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，轉至 PVDF膜上。用含5% BSA的PBS對膜進行封閉，然后，將膜孵育于STAT5、phospho-STAT5、p70S6K、phospho-p70S6K一抗中4℃過夜，再孵育二抗1 h，最后對蛋白質(zhì)進行可視化的增強化學發(fā)光。

3 結果

3.1PO-291體外抑制T細胞增殖且無明顯細胞毒性為了探究PO-291的免疫抑制活性，采用CFSE分子標記法，結合流式細胞術檢測PO-291作用于人T細胞增殖的機制。如Fig 2所示，PO-291對由抗CD3/抗CD28或同種異型抗原活化的T細胞增殖具有抑制作用，IC50分別為(8.09±1.04)μmol·L-1、(8.01±0.95)μmol·L-1。

為了檢驗PO-291的抑制機制是由于免疫抑制活性，而并非細胞毒性，我們采用流式細胞術檢測PO-291作用于人活化T細胞后細胞的凋亡情況，分析藥物作用于靜息T細胞和PBMC后細胞的增殖活性。如Fig 3所示，在完全抑制活化T細胞增殖的濃度下，24、48 h內(nèi)PO-291均不誘導活化的T細胞凋亡，且不對靜息的T細胞及PBMC的細胞活力產(chǎn)生較大的影響，說明PO-291具有明顯的免疫抑制活性，且無明顯細胞毒性。

Fig 2 T cell proliferation in vitro inhibited by

The CFSE-labeled T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20, 40, 80 μmol·L-1) and activated with anti-CD3/anti-CD28 (A, B) or allogeneic PBMCs (C) for 72 h. Cell proliferation was measured by flow cytometry. The cells without stimulator and PO-291 served as negative control (0%), while those with stimulator, but without PO-291 served as the positive control (100%).

Fig 3 No significant cytotoxicity of PO-291 in

T cells were treated with PO-291 (10, 20, 40 μmol·L-1), RAPA (0.1 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 24 h or 48 h. Cell apoptosis was assessed by flow cytometry with Annexin V and PI dual staining (A). Na?ve T cells (B) and PBMC (C) were treated with PO-291 (10, 20, 40, 80, 160 μmol·L-1) or vehicle for 72 h. The flow cytometry with PI staining was used to assess the viability of cells. The cells without drug served as control (100%).

3.2PO-291對T細胞的活化無抑制作用CD25和CD69的表達，以及IL-2的分泌是T細胞活化的標志。與先前報道[10]類似，F(xiàn)K506明顯抑制活化T細胞CD25和CD69的表達以及IL-2的分泌。本實驗結果顯示，PO-291不同于FK506，對CD25、CD69表達以及IL-2產(chǎn)生無明顯影響(Fig 4)，說明PO-291對T細胞的活化無明顯抑制作用。

3.3PO-291誘導T細胞周期阻滯于G0/G1期

Fig 4 T cell activation not inhibited by

T cells were treated with PO-291 (10, 20, 40 μmol·L-1), FK506 (0.1 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 24 h. The expression of CD25 and CD69 was analyzed on a flow cytometry (A, B). The supernatant was harvested and the level of IL-2 was assessed by ELISA (C).*P<0.05vsgroup of activated without drug.

Fig5TcellcyclearrestinducedbyPO-291

T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20 μmol·L-1) or RAPA (0.1 μmol·L-1) and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 72 h. Cell cycle progression was analyzed by flow cytometry. A: Representative flow cytometry histograms; B: Quantitative analysis of the percentages of cells in the G0/G1phase.*P<0.05vsgroup of activated without drug.

細胞周期的循環(huán)在細胞增殖中扮演了重要的角色[11]。為了探究PO-291對細胞周期循環(huán)的影響，我們采用流式細胞術檢測T細胞內(nèi)DNA在各細胞周期的含量。如Fig 5所示，與RAPA作用于T細胞的結果相似，PO-291使T細胞內(nèi)DNA在G0/G1期的百分比明顯增加，表明PO-291可誘導T細胞周期阻滯于G0/G1期。

3.4PO-291抑制活化T細胞中促炎因子的產(chǎn)生為了探究PO-291對促炎和抗炎細胞因子的影響，ELISA法檢測了活化T細胞上清液中IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-2、IL-4、IL-10的分泌水平。如Fig 6所示，PO-291明顯抑制活化T細胞中IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌，但對IL-2、IL-4、IL-10無明顯影響。表明PO-291對調(diào)節(jié)性T細胞釋放抗炎細胞因子無明顯影響，但明顯抑制Th1、Th17細胞釋放促炎性細胞因子。

3.5PO-291影響由IL-2活化的T細胞JAK3/STAT5信號通路為了進一步揭示PO-291對T細胞增殖的調(diào)控機制，分別采用流式細胞術和蛋白免疫印跡法分析 PO-291對由IL-2活化的T細胞的增殖和相關信號通路的影響。如Fig 7所示，IC50為(7.68±0.51)μmol·L-1時，PO-291抑制IL-2活化的T細胞的增殖。在PO-291的作用下，磷酸化STAT5明顯減少，但磷酸化p70S6K表達增加。說明在相同條件下，PO-291對STAT5和p70S6K的表達無影響，但抑制STAT5磷酸化，且可增強p70S6K磷酸化，提示PO-291通過影響JAK3/STAT5信號通路，抑制T細胞增殖。

4 討論

苯并惡唑是一類含氮雜環(huán)化合物，它們衍生的化合物常具有極高生物活性。我們前期合成了一系列苯并惡唑衍生物，通過T細胞增殖抑制活性篩選平臺的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)其中PO-291對T細胞活化增殖具有極強的抑制性。PO-291的IC50分別為(8.09±1.04)μmol·L-1、(8.01±0.95)μmol·L-1時，可明顯抑制抗CD3/抗CD28或同種異型抗原活化的T細胞增殖。即使?jié)舛冗_到160 μmol·L-1，也未觀察到PO-291對人靜息T細胞以及PBMC具有明顯的細胞毒性。且在完全抑制活化T細胞增殖的藥物濃度下，PO-291不對活化的T細胞產(chǎn)生誘導凋亡的作用。以上結果提示，PO-291對活化的T細胞增殖的抑制作用有選擇性。靜息T細胞接受CD3與CD28的雙信號刺激后，通過激活鈣調(diào)磷酸酶、MAPK、NF-κB 3條信號通路，使IL-2、CD25、CD69等分子表達，活化T細胞[12]。PO-291對IL-2、CD25、CD69的表達均無明顯影響，提示PO-291可能作用于T細胞活化的后期階段。T細胞活化后產(chǎn)生的IL-2與T細胞表面的CD25受體緊密結合，通過信號通路JAK3-STAT5、PI3K-Akt、mTOR-p70S6K等，向細胞內(nèi)傳遞增殖信號，推動細胞周期進程，使細胞從G0/G1期進入S/M期，并開始增殖，形成正反饋環(huán)路[13]。PO-291不抑制活化的T細胞表達CD25、CD69以及分泌IL-2，但可使T細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，說明PO-291作用機制可能為阻斷T細胞活化后期過程中的關鍵信號通路。本實驗僅通過流式細胞術檢測了藥物PO-291對活化的T細胞周期的影響，而并未檢測PO-291對調(diào)控細胞周期的蛋白的影響，我們將在下一步實驗中探究調(diào)控細胞周期G0的蛋白如Cyclin D3、CDK6的變化。

Fig 6 PO-291 inhibited proinflammatory cytokines production but not anti-inflammatory cytokines in activated T

T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20 μmol·L-1), LY-294002 (50 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 48 h. The supernatants were collected and the levels of IFN-γ (A), IL-6 (B), IL-17 (C), IL-2 (D), IL-4 (E) or IL-10 (F) were measured by ELISA.*P<0.05vsgroup of activated without drug.

Fig 7 JAK3/STAT5 signaling pathway in IL-2-stimulated activated T cells affected by

The CFSE-labeled activated T cells were treated with PO-291 and stimulated by IL-2 for 72 h. Cell proliferation was measured by flow cytometry (A). The activated T cells were then treated with PO-291(10, 20, 40 μmol·L-1), AG-490 (50 μmol·L-1), RAPA (0.1 μmol·L-1) or vehicle for 6 h. Subsequently, T cells were induced by IL-2 for 30 min and the relative phosphorylation and expression levels of STAT5 (B) and p70S6K (C) were assessed by Western blot.*P<0.05vscontrol group.

活化的CD4+T細胞可向Th1、Th2、Th17或Treg分化[14]。Th1細胞分泌IFN-γ，Treg可分泌IL-10，IL-6是調(diào)控Th17分化的重要細胞因子，而Th17細胞可分泌IL-17。實驗結果顯示，PO-291對IL-4、IL-10的產(chǎn)生不具有明顯影響，但明顯抑制促炎細胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17的產(chǎn)生。提示PO-291可能參與調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化為Th1、Th2、Th17或Treg的過程。

在研究活化的T細胞JAK3/STAT5信號通路時，我們發(fā)現(xiàn)PO-291對STAT5的表達無影響，但可抑制磷酸化STAT5的表達，提示PO-291可能通過影響JAK3/STAT5信號通路來抑制T細胞增殖。查閱文獻資料發(fā)現(xiàn)，低水平的STAT5對于p70S6K通路的持續(xù)激活是非常必要的[15]，若磷酸化STAT5受到抑制，磷酸化p70S6K的表達無影響或者同樣受到抑制。而我們進一步研究活化的T細胞mTOR/p70S6K信號通路時，發(fā)現(xiàn)PO-291對p70S6K的表達無影響的情況下，抑制了磷酸化STAT5表達的同時，卻增強了磷酸化p70S6K的表達。在后期查閱的大量文獻中并未發(fā)現(xiàn)相關的報道，根據(jù)現(xiàn)有實驗結果推測，JAK3/STAT5和mTOR/p70S6K兩條信號通路之間存在某種關聯(lián)，可使一條通路在受到藥物抑制時，信號通過另一條信號通路進行傳導。因此，下一步我們將進一步探究兩條信號通路之間的關系，解答本實驗中的疑惑，并且將繼續(xù)探索PO-291可能作用的其他關鍵信號通路。

綜上所述，苯并惡唑衍生物PO-291不影響T細胞的活化，但通過使細胞周期停滯于G0/G1期，對活化的T細胞增殖產(chǎn)生抑制?，F(xiàn)階段常見免疫抑制劑的結構與PO-291的結構迥異，也與現(xiàn)有處于臨床試驗階段的新型化合物差異較大[16]。因此，PO-291有望作為先導化合物，為開發(fā)用于器官移植以及自身免疫性疾病的新型藥物提供新的方向。

(致謝：本實驗在成都醫(yī)學院科研實驗中心完成。感謝各位老師和同學對本實驗提供的幫助與支持。)

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