徐穎凱，馮先慧，王紅偉，楊 偉，楊 樺*

(1.四川省環(huán)科源科技有限公司,四川 成都 610041; 2.江油市彰明林業(yè)站,四川 江油 621700;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院四川省林業(yè)生態(tài)工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611130)

植物揮發(fā)物是由植物表面或葉中積累的貯存位點(diǎn)所釋放的揮發(fā)性物質(zhì)，屬于植物次生性化學(xué)物質(zhì)，由一些相對(duì)分子量在100～200的烴類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、含氮化合物、有機(jī)酸和有機(jī)硫等有機(jī)化學(xué)物質(zhì)組成的混合物，并以一定的比例構(gòu)成了該種植物特定的化學(xué)指紋圖譜[1～4]。化學(xué)指紋圖譜對(duì)引導(dǎo)昆蟲(chóng)產(chǎn)卵、刺激昆蟲(chóng)取食、誘導(dǎo)昆蟲(chóng)交配和繁殖及昆蟲(chóng)趨向性等行為都有調(diào)控作用[5～8]。例如，Schoonhoven等[9]在研究馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata對(duì)馬鈴薯Solanumtuberosum葉片氣味的定向選擇行為中發(fā)現(xiàn)，只要有馬鈴薯葉片氣味存在，馬鈴薯甲蟲(chóng)就會(huì)產(chǎn)生寄主定向行為；小菜蛾P(guān)lutellaxylostella可以利用十字花科植物所釋放的揮發(fā)物芥子油而準(zhǔn)確地找到寄主植物并進(jìn)行取食、產(chǎn)卵[10]；胡蘿卜花中有5種成分對(duì)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera取食有很強(qiáng)烈的引誘作用[11]；美洲棉鈴蟲(chóng)H.zea的寄主棉花、番茄等作物所散發(fā)的一些揮發(fā)性物質(zhì)，可以明顯地誘導(dǎo)已交配雌蛾產(chǎn)生定向行為，并刺激雌蛾產(chǎn)卵[12]。

橫坑切梢小蠹屬于鞘翅目Coleoptera，小蠹科Scolytidae，切梢小蠹屬Tomicus，是一種重要的林木蛀干害蟲(chóng)，主要危害云南松Pinusyunnanensis、馬尾松P.massoniana、油松P.tabuliformis等松屬類(lèi)植物。橫坑切梢小蠹國(guó)外主要分布在日本、俄羅斯、法國(guó)、丹麥等國(guó)家，在我國(guó)分布于河南、四川、陜西、江西、云南等地[13]。由于該蟲(chóng)隱蔽性強(qiáng)、世代重疊嚴(yán)重，造成其蟲(chóng)情調(diào)查和監(jiān)測(cè)難度較大，常造成松樹(shù)的成片枯死，給林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)造成了巨大損失。橫坑切梢小蠹成蟲(chóng)羽化后，飛到臨近云南松樹(shù)冠，蛀食嫩梢補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，到成蟲(chóng)性發(fā)育成熟后便會(huì)陸續(xù)從枝梢轉(zhuǎn)移到樹(shù)干進(jìn)行交配產(chǎn)卵。而且小蠹類(lèi)害蟲(chóng)是通過(guò)化學(xué)信息素進(jìn)行寄主的搜尋、定位和種群的信息交流。因此，采用萃取蒸餾結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，分析鑒定橫坑切梢小蠹補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)部位和產(chǎn)卵部位揮發(fā)性成分，比較其差異，為高效利用信息素對(duì)該類(lèi)害蟲(chóng)的種群監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年7月中旬在四川省甘孜州瀘定縣二郎山云南松林，采取云南松健康、無(wú)霉變和無(wú)開(kāi)口裂縫，且新鮮的韌皮部，以及當(dāng)年生健康枝梢。在離地面約2 m的樹(shù)干上，割下其韌皮部，同時(shí)采取每株樹(shù)上直徑為0.5 cm～1.5 cm的云南松枝梢，并迅速分別放入采樣袋里密封后，放入加有冰袋的醫(yī)用冷藏箱中。將枝梢?guī)Щ厥覂?nèi)及時(shí)處理并提取揮發(fā)物，進(jìn)行后續(xù)揮發(fā)物的提取。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀，配有HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國(guó)安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(PRA-202C)，中國(guó)普渡科技公司。

1.3 方法

1.3.1 云南松揮發(fā)物

提取將采集的云南松針葉與樹(shù)皮分別洗凈，剪成1 cm長(zhǎng)的小段，分別稱(chēng)取600 g材料放入水蒸氣蒸餾裝置內(nèi)，加入1 200 mL去離子水，連續(xù)蒸餾4 h，餾出液用無(wú)水乙醚萃取，加入無(wú)水硫酸鈉脫水，低溫濃縮下除去乙醚，得到具有濃郁芳香氣味的淡黃色透明油狀物，在-80℃超低溫冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 成分分析與鑒定

揮發(fā)性成分的檢測(cè)條件參照蔣麗等[14]。對(duì)提取的揮發(fā)物利用重蒸正己烷進(jìn)行稀釋1 000倍后進(jìn)行分析，氣相色譜條件：使用30 cm × 0.25 mm × 25 μm 厚涂層的HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱，流速1.2 mL·min-1，初始溫度70℃，保留1 min；以10℃·min-1的速度由70℃升至100℃，保持1 min；再以10、5、10、3、20℃·min-1的速度分別升到122℃、141℃、160℃、190℃、250℃；250℃保持2 min。進(jìn)樣量1 μL，分流比為20∶1，載氣為高純氦氣(He)，流速為24 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源(EI)，電子轟擊電壓70 eV，進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度200℃，掃描速度0.4 s，掃描范圍m/z 40～450，燈絲電流150 μA。對(duì)所得通過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索對(duì)照，確定化學(xué)組分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將檢測(cè)的未知化合物(揮發(fā)性成分)與NIST.11 library進(jìn)行匹配，對(duì)匹配度大于800(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)，并以峰面積歸一化法確定各化合物的相對(duì)含量。用Origin繪圖軟件對(duì)獲得的總離子流圖進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

云南松針葉的揮發(fā)性成分的總離子圖見(jiàn)圖1。通過(guò)GC-MS分析鑒定出35種化學(xué)物質(zhì)，鑒定出來(lái)的化合物占提取的揮發(fā)物組分色譜峰面積的87.47%(表1)。在所鑒定的化合物中，萜烯類(lèi)物質(zhì)24種，共占峰面積的81.05%；醇類(lèi)物質(zhì)5種，共占峰面積的3.84%；酮類(lèi)物質(zhì)兩種，共占峰面積的1.18%；醚類(lèi)、酚類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)各1種，分別占峰面積的0.03%、0.51%和0.72%；萘占峰面積的0.14%。云南松針葉提取的揮發(fā)性成分中峰面積較高的有：蓽澄茄油烯(42.29%)，β-石竹烯(13.64%)，

β-水芹烯(5.26%)， β-蒎烯(4.99%)，云南松樹(shù)皮揮發(fā)物成分的總離子圖見(jiàn)圖2。通過(guò)GC-MS分析鑒定出34種化學(xué)物質(zhì)，鑒定出來(lái)的化合物占提取的揮發(fā)物組分色譜峰面積的97.98%(表2)。在所鑒定的化合物中，萜烯類(lèi)物質(zhì)22種，共占峰面積的92.24%；醇類(lèi)物質(zhì)5種，共占峰面積的3.22%；酮類(lèi)和苯類(lèi)物質(zhì)各有兩種，分別占峰面積的0.22%和0.29%；醚類(lèi)、酚類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)各1種，分別占峰面積的0.29%、0.71%、和1.01%。云南松樹(shù)皮提取的揮發(fā)性成分中峰面積較高的有：β-蒎烯(27.68%)，β-石竹烯(17.56%)，β-水芹烯(17.18%)，(+)-α-蒎烯(12.72%)，2-側(cè)柏烯(7.05%)，長(zhǎng)葉烯(4.52%)，α-石竹烯(2.7%)，α-松油醇(1.79%)，乙酸冰片酯(1.01%)。

圖1 云南松針葉提取物GC-MS總離子圖Fig 1 The GC-MS total lion chromatogram of extracts from needles of P.yunnanensis

表1云南松針葉揮發(fā)性成分

Tab.1 The volatile compositions from needles of P.yunnanensis

(﹢)-α蒎烯(4.78%)，α-石竹烯(2.62%)，α-衣蘭油烯(2.62%)，T-杜松醇(1.89%)，γ-杜松烯(1.48%)，α-松油醇(1.35%)。

圖1 云南松樹(shù)皮提取物GC-MS總離子圖Fig.2 The GC-MS total lion chromatogram of extracts from bark of P.yunnanensis

表2云南松樹(shù)皮揮發(fā)性成分

續(xù)表2

序號(hào)No.保留時(shí)間Retention time/min化合物Compound相對(duì)分子質(zhì)量Relative molecular mass分子式Molecular fomula相對(duì)含量Relative content(%)相似度Similarity(%)2311.441(+)-環(huán)長(zhǎng)葉烯204.35C15H240.14942411.487α-蒎烯136.24C10H160.13932511.784(+)-苜蓿烯204.35C15H240.09992612.099長(zhǎng)葉烯204.35C15H244.52992712.2482-叔丁基-1,4-二甲氧基苯194.27C12H18O20.22932812.322β-石竹烯204.35C15H2417.56992912.831(E)-β-金合歡烯204.35C15H240.1933012.912α-石竹烯204.35C15H242.7963113.375蓽澄茄油烯204.35C15H240.3953213.673α-衣蘭油烯204.35C15H240.11913313.852,6-二叔丁基對(duì)甲酚220.35C15H24O0.71983414.085δ-杜松烯204.35C15H240.1493

由表3可見(jiàn)，云南松針葉和樹(shù)皮共有22種揮發(fā)性成分，其中萜烯類(lèi)占了18種，醇類(lèi)1種，酯類(lèi)1種，酚類(lèi)1種。綜上，云南松針葉揮發(fā)性成分相對(duì)含量中有88.58%與云南松樹(shù)皮相同；云南松樹(shù)皮發(fā)揮性成分相對(duì)含量中有81.88%與針葉相同。

表3云南松針葉和樹(shù)皮的相同揮發(fā)性成分

Tab.3 Identical volatile components inP.yunnanensisbark and needles

化合物Compound物質(zhì)種類(lèi)Substance species相對(duì)含量(%) Relative content針葉 needles樹(shù)皮 bark三環(huán)烯萜烯類(lèi)0.050.06(+)-α-蒎烯萜烯類(lèi)12.724.78莰烯萜烯類(lèi)0.280.27檜烯萜烯類(lèi)0.230.06β-蒎烯萜烯類(lèi)27.684.993-蒈烯萜烯類(lèi)0.090.13β-水芹烯萜烯類(lèi)17.185.26γ-松油烯萜烯類(lèi)0.110.08異松油烯萜烯類(lèi)0.750.42樟腦萜烯類(lèi)0.130.85α-松油醇醇類(lèi)1.791.352-異丙基-5-甲基茴香醚醚類(lèi)0.290.03乙酸冰片酯酯類(lèi)1.010.72α-蒎烯萜烯類(lèi)0.130.50長(zhǎng)葉烯萜烯類(lèi)4.520.10β-石竹烯萜烯類(lèi)17.5613.64(E)-β-金合歡烯萜烯類(lèi)0.100.42α-石竹烯萜烯類(lèi)2.702.62蓽澄茄油烯萜烯類(lèi)0.3042.29α-衣蘭油烯萜烯類(lèi)0.112.622,6-二叔丁基對(duì)甲酚酚類(lèi)0.710.51δ-杜松烯萜烯類(lèi)0.140.18

3 討論

云南松針葉和樹(shù)皮揮發(fā)性成分在組成和含量上差別很大。在針葉和樹(shù)皮揮發(fā)性成分中，(+)-α-蒎烯相對(duì)含量分別為12.72%和4.78%，β-蒎烯為27.68%和4.99%，β-水芹烯為17.18%和5.26%，異松油烯為0.75%和0.42%，長(zhǎng)葉烯為4.52%和0.1%，β-石竹烯為17.56%和13.64%，(E)-β-金合歡烯為0.1%和0.42%，蓽澄茄油烯為0.3%和42.29%。樹(shù)皮中桃金娘烯醇含量為0.7%，馬鞭草烯酮含量為0.09%，而松針中則沒(méi)檢測(cè)到這兩種物質(zhì)。殷彩霞等[15]利用石油醚浸泡昆明地區(qū)云南松的枝梢韌皮部和松針發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯在二者提取物種的相對(duì)含量分別為47.13%和9.14%，β-蒎烯含量為10.93%和1.79%；β-水芹烯為21.97%，而松針中則未檢測(cè)到。楊燕等[16]對(duì)貴州地區(qū)的云南松松針進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取分析發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯相對(duì)含量為 4.141%、β-蒎烯為0.856%、異松油烯為0.402%、β-蓽澄茄烯為0.489%、α-松油醇為0.715%、大根香葉烯D為15.045%、十六酰胺為16.581%和β-石竹烯為4.473%。伍蘇然等[17]利用采用頂空吸附法收集的云南松健康松和衰弱松針葉自然揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為α-蒎烯(73.43%和21.24%)、β-蒎烯(13.28%和28.54%)、檸檬烯(4.58%和23.01% )，并推測(cè)α-蒎烯與β-蒎烯的相對(duì)比例的變化是云南松樹(shù)勢(shì)衰弱程度變化的一個(gè)重要信號(hào)。

本研究中在云南松樹(shù)皮揮發(fā)性成分中檢測(cè)到了馬鞭烯酮和桃金娘烯醇，而在其他研究中這兩種物質(zhì)則是在小蠹蟲(chóng)的后腸提取物中才被檢測(cè)到的[18]，是不是對(duì)橫坑切梢小蠹后腸提取物進(jìn)行分析，也可以發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)，是否為橫坑切梢小蠹的性信息素，還需進(jìn)一步研究。

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