舒心媛，嚴(yán)旭，蒲燁弘，王超，潘建偉*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000）

基因編輯技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，主要通過(guò)利用序列特異性的核酸酶在DNA特定位點(diǎn)引入或缺失堿基，產(chǎn)生高頻誘導(dǎo)突變，對(duì)目標(biāo)基因或特定DNA片段進(jìn)行“編輯”，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因或特定DNA片段的敲除或加入。由于此技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，引起了廣大科技工作者的關(guān)注。

基因編輯技術(shù)的發(fā)展大致經(jīng)歷了3個(gè)階段。第一代技術(shù)主要指鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger nucleases,ZFN）編輯技術(shù)，是第一個(gè)設(shè)計(jì)出能在特定DNA序列切割的人工核酸酶。鋅指DNA結(jié)合蛋白與FokⅠ核酸內(nèi)切酶融合行使切割作用，在特定的位點(diǎn)產(chǎn)生突變。但ZFN編輯技術(shù)因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、重復(fù)單元有限、高頻脫靶及細(xì)胞毒性等不足，最終沒(méi)有被廣泛應(yīng)用[1-2]。第二代技術(shù)是以類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）為代表的編輯技術(shù)。類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcription activator-like effector,TALE）是天然的細(xì)菌效應(yīng)蛋白，能在宿主植物體中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[3]。TALEN由TALE結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合組成，與ZFN技術(shù)相比，具有設(shè)計(jì)容易、突變率高等優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)其報(bào)道相對(duì)較多。第三代技術(shù)是CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas）編輯技術(shù)，因其具有成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具[4-5]。鑒于目前CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在生命科學(xué)各研究領(lǐng)域中廣泛使用，并且國(guó)內(nèi)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有一些較好的中文綜述[6-7]，因此本文在扼要介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，著重介紹CRISPR/Cas9的作用原理及其在作物中的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)功能與類(lèi)型

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas系統(tǒng)最早是在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，主要用于對(duì)抗入侵病毒或外源DNA。1987年，日本學(xué)者在研究大腸埃希菌編碼的堿性磷酸酶基因編碼區(qū)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其下游區(qū)域有29 bp的重復(fù)片段和32～33 bp的間隔片段相連的重復(fù)序列，即所謂的“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”（CRISPR）[8]。該序列于2002年被正式命名為CRISPR[9]。目前已知的90%古細(xì)菌和40%真細(xì)菌的基因組均含有CRISPR/Cas系統(tǒng)，這是古細(xì)菌和真細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種獲得性免疫系統(tǒng)[10]。CRISPR/Cas系統(tǒng)均由CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated,Cas）編碼的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶、相似的回文重復(fù)序列和非編碼的短RNAs組成[11]。不同CRISPR/Cas系統(tǒng)的重復(fù)序列長(zhǎng)度大致為23～47 bp。在同一物種中，CRISPR的重復(fù)序列是高度保守的，在一些近緣種間也具有一定的相似性。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)及其功能

CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)由CRISPR基因[包括前導(dǎo)序列（leader sequence）、重復(fù)-間隔序列（repeat-spacer sequences）和回文重復(fù)序列（palindromic repeat sequences）]、Cas核酸內(nèi)切酶基因和不編碼的RNA[包括CRISPR來(lái)源的RNA（CRISPR-derived RNA,pre-crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA）]組成（圖1）。前導(dǎo)序列是一段與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的保守序列，位于CRISPR上游。間隔序列由病毒或質(zhì)粒的核酸衍生而來(lái)，常被用作識(shí)別元件去尋找與之相匹配的序列并摧毀它。回文重復(fù)序列對(duì)于間隔序列在基因座的位置和方向起決定性作用[12]。原間隔序列（proto-spacers）位于原間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motifs,PAM）兩側(cè)，并在免疫的第一階段產(chǎn)生間隔序列。Cas蛋白復(fù)合體是由CRISPR基因附近的一個(gè)基因簇編碼，具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性和各種RNA結(jié)合蛋白特性的結(jié)構(gòu)域[13]。由于Cas蛋白復(fù)合體與CRISPR基因共同進(jìn)化、共同發(fā)揮作用，因而被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因。在原核基因組中，目前已知的Cas蛋白家族有40多個(gè)，在crRNA形成、外源DNA的整合和剪切中發(fā)揮重要作用[14]。tracrRNA位于CRISPR關(guān)聯(lián)基因Cas及前導(dǎo)序列-重復(fù)-間隔序列陣列鏈的反方向，介導(dǎo)非編碼RNA（precrRNA）的成熟以獲得crRNA[15]。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的類(lèi)型

目前已知，不同真細(xì)菌或古細(xì)菌在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中分離出多種CRISPR/Cas系統(tǒng)，可分為2大類(lèi)別、共16種CRISPR/Cas子型免疫系統(tǒng)[13]。其中：類(lèi)別1包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型共12種CRISPR/Cas系統(tǒng)，需多個(gè)Cas蛋白組成的復(fù)合體共同發(fā)揮作用；類(lèi)別2包含Ⅱ和Ⅴ型共4種CRISPR/Cas系統(tǒng)，只需1個(gè)Cas蛋白效應(yīng)器。Cas9、Cpf1、C2c1和C2c3是類(lèi)別2中已知的核酸內(nèi)切酶蛋白[16]。

Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型是CRISPR/Cas系統(tǒng)中最經(jīng)典的3種類(lèi)型[17]，這3類(lèi)系統(tǒng)均含有成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列、操縱子操縱的基因（Cas）和決定切割位點(diǎn)特異性的非編碼RNA，并且分別擁有各自獨(dú)特的Cas效應(yīng)蛋白，如Ⅰ型Cas3、Ⅱ型Cas9和Ⅲ型Cas10[18]。Ⅰ和Ⅲ型系統(tǒng)具有一些相同的特征，利用Cas6核酸酶加工前體crRNA，待前體crRNA成熟以后，每個(gè)crRNA聚集到由多個(gè)Cas蛋白組成的復(fù)合體中，然后識(shí)別并切割與crRNA互補(bǔ)的核苷酸鏈[19]。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)是從化膿鏈球菌中分離出來(lái)的免疫系統(tǒng)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這種類(lèi)型只需1個(gè)Cas9蛋白即能在特定位點(diǎn)發(fā)揮基因編輯效應(yīng)。大多數(shù)Ⅰ型CRISPR系統(tǒng)中的Cas2和Cas3蛋白分別參與到外源基因的適應(yīng)和干擾階段。但是在綠膿假單胞菌分離出的Ⅰ-F系統(tǒng)中，這些蛋白融合成1個(gè)多肽，Cas1亞基抑制Cas2/3核酸酶活性，由Csy復(fù)合物識(shí)別外源DNA并激活Cas2/3核酸酶活性，誘導(dǎo)DNA雙向降解[20]。

此外，最近有研究者從細(xì)菌中分離出了2種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)：CRISPR/CasX和CRISPR/CasY[21]。在CRISPR/CasX系統(tǒng)中，CRISPR陣列編碼Cas1、Cas2、Cas4和Casx基因，CasX蛋白僅有RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域。而CRISPR/CasY系統(tǒng)較特殊，CRISPR陣列中的間隔序列比所有已知的CRISPR系統(tǒng)短，并且CasY蛋白結(jié)構(gòu)域僅與C2c3的RuvC核酸酶相似。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理

在眾多CRISPR/Cas系統(tǒng)中，迄今為止對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能研究最多，對(duì)其作用原理的剖析也相對(duì)較為透徹。因此，本節(jié)將主要介紹其分子作用機(jī)制。

從釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中分離出的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)主要由3個(gè)作用元件組成：Cas9蛋白、crRNA和trancrRNA。不同物種的Cas9蛋白氨基酸長(zhǎng)度在950～1 600之間[22]。目前已知，Cas9蛋白具有HNH和RuvC 2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別切割DNA靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的2條單鏈[23]。另外，Cas9核酸酶具有2個(gè)功能：識(shí)別間隔毗鄰基序PAM，并與sgRNA、靶位點(diǎn)DNA互作。tracrRNA序列與precrRNA轉(zhuǎn)錄的重復(fù)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而介導(dǎo)precrRNA的加工并釋放出成熟的crRNA。此過(guò)程需要RNA聚合酶Ⅲ和Csn1的參與。在Csn1存在的情況下，引導(dǎo)雙鏈RNA被識(shí)別并由RNase在其特定的位點(diǎn)切割成多個(gè)單元。這些獨(dú)立的單元經(jīng)進(jìn)一步加工，最終形成成熟的crRNA。在核內(nèi)小RNA（snRNA）啟動(dòng)子U6或U3存在的情況下，crRNA與trancrRNA配對(duì)形成單向?qū)NA（single guide RNA,sgRNA），可有效表達(dá)[24]。sgRNA是一個(gè)由crRNA:tracrRNA雙鏈融合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的嵌合體，由小于100 bp的短序列編碼。sgRNA的PAM 5'-NGG-3'序列上游的20bp序列決定了CRISPR/cas9系統(tǒng)靶位點(diǎn)的特異性[25]。Cas9與crRNA:tracrRNA組成的復(fù)合物對(duì)PAM的識(shí)別是DNA解旋和靶位點(diǎn)片段與sgRNA形成雜合結(jié)構(gòu)的先決條件[26]。PAM的典型序列為“5'-NGG”，但不同系統(tǒng)的PAM序列和位點(diǎn)有所不同，比如“5'-NNAGAA”“5'-NGGNG”或“5'-NNNNGATT”[11]，這可能與R環(huán)（R-loop）結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[27]。

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，位點(diǎn)特異性的斷裂是由crRNA、靶位點(diǎn)間隔序列DNA及間隔序列毗鄰基序PAM之間的互補(bǔ)性決定的[28]。sgRNA序列中的20 bp序列是在基因組中所要尋找的目標(biāo)靶序列。一旦靶序列與sgRNA互補(bǔ)配對(duì)，激活Cas9識(shí)別crRNA和靶基因上游的基序PAM，從而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。Cas9蛋白的2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域在PAM上游的3～4 bp處產(chǎn)生平末端的雙鏈切口[29]，其中，RuvC核酸內(nèi)切酶切割與crRNA互補(bǔ)的靶序列單鏈，而HNH核酸內(nèi)切酶切割對(duì)應(yīng)的非互補(bǔ)單鏈[30]（圖2）。雙鏈斷裂同時(shí)誘導(dǎo)2種不同的修復(fù)機(jī)制：同源重組（homology-directed repair,HDR）和非同源重組（non-homologous end joining,NHEJ）。非同源重組是體細(xì)胞中最常見(jiàn)的易錯(cuò)修復(fù)機(jī)制，往往會(huì)出現(xiàn)缺失、插入、染色體倒置和易位等現(xiàn)象，而同源重組很少出錯(cuò)。因此，利用外源提供的DNA模板可在雙鏈斷裂位點(diǎn)提高基因編輯的精確性和實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)基因的插入[31-32]。有研究發(fā)現(xiàn)，在水稻和擬南芥中，64%～75%CRISPR編輯產(chǎn)生的突變體為單堿基缺失或插入[33]；因此，理論上可通過(guò)設(shè)計(jì)不同的sgRNA，由Cas9核酸酶識(shí)別任何帶有PAM并與sgRNA特異性互補(bǔ)的靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因不同程度的編輯。

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理圖[30]Fig.2 Action mechanism of CRISPR/Cas9 system[30]

在細(xì)菌中，不同種類(lèi)的CRISPR/Cas免疫機(jī)制主要包括間隔序列獲取、crRNA形成和干擾3個(gè)階段[34-36]。在間隔序列獲取階段，Cas1/Cas2蛋白輔以Cas4（Ⅱ-B和Ⅱ-C中Cas4的同源蛋白）、Csn2（Ⅱ-A）和Cas9（Ⅱ-A）參與外源核苷酸片段（原間隔序列）插入到重復(fù)間隔序列中成為新間隔序列。這些新的間隔序列成為外源因子再次入侵細(xì)菌的“分子記憶”；當(dāng)再次入侵時(shí)，沉默外源核苷酸片段。原間隔序列的識(shí)別需要靶位點(diǎn)毗鄰的PAM（NGG）序列[37]。在crRNA形成階段，無(wú)論是Cas6核酸內(nèi)切酶（Ⅰ和Ⅲ）或Cas9與tracrRNA、RNA核酸酶Ⅲ的作用（Ⅱ），還是Cpf1（Ⅴ-A）、C2c2（Ⅵ）在串聯(lián)區(qū)域發(fā)揮作用，都能使pre-crRNA分子加工形成成熟的crRNA。在干擾階段，Cas蛋白通過(guò)識(shí)別原間隔基序PAM來(lái)結(jié)合與crRNA互補(bǔ)的靶位點(diǎn)序列。Cas3（Ⅰ）、Cas10（Ⅲ）、Cas9（Ⅱ）和Cpf1/C2c1（Ⅴ-A/B）利用各自的核酸酶結(jié)構(gòu)域在靶位點(diǎn)區(qū)域切割雙鏈[38-39]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，從氨基酸球菌屬中分離出的CRISPR/Cpf1(Ⅴ-A)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物特定位點(diǎn)中的編輯效率更高[40]。單個(gè)crRNA、重復(fù)序列與間隔序列有效地引導(dǎo)AsCpf1核酸內(nèi)切酶在特定靶位點(diǎn)切割DNA雙鏈[41]。AsCpf1是核糖核酸酶（也稱(chēng)Cas12a），僅有1個(gè)RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域。Cpf1與Cas9蛋白的區(qū)別在于：1）Cpf1僅由crRNA向?qū)?，不需要tracrRNA參與；2）Cpf1所需的crRNA序列長(zhǎng)度短；3）Cpf1識(shí)別富含T的PAM（5'-TTTN-3'），但Cas9識(shí)別富含G的PAM；4）Cpf1在PAM遠(yuǎn)端斷裂產(chǎn)生黏性末端，而Cas9在PAM近端產(chǎn)生平末端；5）Cpf1核酸酶可加工crRNA陣列以獲得成熟的crRNAs[42-43]等。

3 CRISPR在作物中的應(yīng)用

對(duì)作物關(guān)鍵功能基因的挖掘與利用是作物產(chǎn)量和品質(zhì)遺傳改良的重要途徑，但獲得功能缺失突變體是基因遺傳功能鑒定的必要前提。EMS誘變、T-DNA插入突變、轉(zhuǎn)座子插入突變和RNA干涉等傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究策略，因其突變位點(diǎn)隨機(jī)性的特點(diǎn)大大限制了目標(biāo)基因的功能鑒定。而CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)具有高效、定向突變等優(yōu)點(diǎn)，幾乎可以定向敲除任何一個(gè)功能基因，因此在作物關(guān)鍵功能基因的挖掘與利用研究領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用前景，倍受廣大植物學(xué)家的青睞。近年來(lái)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在模式植物擬南芥和煙草等農(nóng)作物中已有較好的應(yīng)用，本節(jié)集中介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)在一些重要農(nóng)作物中的應(yīng)用。

3.1 單子葉作物

目前，水稻（Oryza sativa）是CRISPR/Cas9應(yīng)用最成功的作物之一。有研究表明，在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的T0代突變體中，獲得純合體或雙等位基因的概率高達(dá)90%[30]。LOWDER等[44]根據(jù)水稻目的基因OsYSA和OsROC5的序列，分別設(shè)計(jì)了由U6和U3啟動(dòng)子介導(dǎo)產(chǎn)生的sgRNA，這2個(gè)突變體分別表現(xiàn)出白化幼苗和葉卷曲等表型，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變體靶位點(diǎn)缺失200 bp片段。同樣，水稻基因OsPDS或OsBADH2經(jīng)CRISPR/Cas9介導(dǎo)敲除后的突變體表現(xiàn)出白化矮小表型[45]。野生型水稻葉片呈現(xiàn)紫色，由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同時(shí)敲除OsGSTU、OsMRP15和OsANP基因后，導(dǎo)致其突變體葉片呈現(xiàn)綠色[46]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除CAO1和LAZY1基因后，cao1突變體葉片呈淺綠色，lazy1突變體分蘗較分散[47]。OsNramp5經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，水稻谷粒中的鎘含量顯著降低[48]。利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1系統(tǒng)分別敲除水稻OsEPFL9基因，發(fā)現(xiàn)其葉片氣孔密度均顯著下降[49]。經(jīng)CRISPR/Cas9敲除OsHAK1后，水稻突變體的銫含量顯著下降[50]。但OsDERF1和OsMYB1經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，水稻植株的生長(zhǎng)發(fā)育卻沒(méi)有受到任何影響[33]，這可能與基因功能豐余有關(guān)。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也能有效編輯miRNA基因家族。有研究表明，CRISPR/Cas9通過(guò)誘導(dǎo)大片段缺失可敲除OsMIR528的功能，導(dǎo)致Osmir528突變體對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)為敏感[51]。綜上表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能高效地定向編輯水稻基因組，相關(guān)分析結(jié)果總結(jié)見(jiàn)表1。

小麥（Triticum aestivum）是由A、B和D 3個(gè)亞基因組組成的異源六倍體單子葉作物，但其染色體多倍性、基因組大、重復(fù)序列含量高等特點(diǎn)大大限制了傳統(tǒng)基因功能修飾技術(shù)的應(yīng)用，如病毒誘導(dǎo)的基因沉默和RNA干涉等。但是，CRISPR/Cas系統(tǒng)能同時(shí)敲除多個(gè)同源等位基因，從而有效地克服了染色體多倍性問(wèn)題（表1）。小麥α-麥醇溶蛋白家族是與麩質(zhì)過(guò)敏癥及非麩質(zhì)過(guò)敏癥相關(guān)的主要蛋白家族，用傳統(tǒng)的誘變或植物育種方法都無(wú)法得到麩質(zhì)低敏感性的小麥品種。而SáNCHEN-LEóN等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)α-麥醇溶蛋白基因?qū)嵭卸ㄏ蚯贸?，設(shè)計(jì)了2條不同的sgRNA（sgAlpha-1和sgAlpha-2），并分別對(duì)BW028/TAH53 2個(gè)小麥品系及硬質(zhì)小麥DP進(jìn)行育種改良，得到的缺失/插入突變體與野生型相比顯著降低了α-麥醇溶蛋白含量，并且這種性狀可穩(wěn)定遺傳。同樣，MORRAN等[53]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯了小麥干旱反應(yīng)因子結(jié)合蛋白TaDREB2和乙烯響應(yīng)因子TaERF3。已知抗病基因TaEDR1對(duì)小麥抗白粉病起負(fù)調(diào)控作用，當(dāng)EDR1通過(guò)EDR4招募到真菌入侵位點(diǎn)后，與MKK4/MKK5互作負(fù)調(diào)控MPK3和MPK6的蛋白水平及激酶活性，從而影響植株免疫能力[54]。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)同時(shí)敲除小麥TaEDR1的3個(gè)同源基因后，三突突變體表現(xiàn)出對(duì)白粉病的抗性[55]。小麥TaMLO基因編碼抗白粉病的蛋白因子，小麥共有3個(gè)MLO同源基因（TaMLO-A1，TaMLO-B1和TaMLO-D1）。WANG等[56]利用TALEN系統(tǒng)或CRISPR/Cas系統(tǒng)成功編輯了TaMLO-A1基因。此外，UPADHYAY等[57]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)也成功制備了小麥inox和PDS基因的功能缺失突變體。這些研究結(jié)果充分表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)在多倍體小麥基因功能研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

與水稻、小麥相似，CRISPR/Cas編輯技術(shù)在玉米（Zea mays）中也得到了較好的應(yīng)用，尤其在玉米雄性不育、木質(zhì)素合成、抗除草劑、次生代謝物的二次代謝和耐旱性等方面已經(jīng)取得可喜的研究成果[31,58]（表1）。玉米ZmARGOS8是乙烯應(yīng)答反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。在干旱條件下，過(guò)表達(dá)ZmARGOS8能提高玉米轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘變ZmARGOS8，使突變體在玉米啟動(dòng)子GOS2介導(dǎo)下持續(xù)表達(dá)ARGOS8，會(huì)使突變體植株產(chǎn)量明顯增加[58]。玉米IspH蛋白合成基因Zmzb7和內(nèi)源基因PSY1經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯后，突變體幼苗均表現(xiàn)出白化表型[59-60]。同樣，玉米乙酰乳酸合酶基因ZmALS2和雄性育性基因ZmMS45經(jīng)CRISPR/Cas9編輯后，突變體分別表現(xiàn)出氯磺隆抗性和雄性不育表型[31]。

3.2 雙子葉作物

大豆（Glycine max）是二倍體雙子葉作物，盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展很快，但是在大豆作物中的應(yīng)用卻很少。當(dāng)前對(duì)大豆功能基因研究仍依賴(lài)于T-DNA插入突變技術(shù)，同樣存在突變隨機(jī)性的問(wèn)題。從表1中可以發(fā)現(xiàn)：大豆GmPDS基因經(jīng)TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯后，獲得了白化矮小植株表型[61]；同樣，大豆GmALS1基因經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯后，植株獲得了氯磺隆抗性[62]。最新的研究表明，利用CRISPR/Cas等基因編輯系統(tǒng)成功地提高了大豆的干旱抗性、種子出油量和抗除草劑的能力[63-64]。

番茄（Solanum lycopersicum）是一種多肉質(zhì)的雙子葉經(jīng)濟(jì)作物。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改良番茄產(chǎn)量和品質(zhì)也有不少成功報(bào)道（表1）。CLAVATAWUSCHEL（CLV-WUS）是控制分生組織大小的重要信號(hào)途徑。番茄SlCLV3功能缺失引起莖分生組織膨大，從而導(dǎo)致花和果實(shí)發(fā)育缺陷[65]。而RODRIGUEZ-LEAL等[66]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)番茄SlCLV3啟動(dòng)子序列（2 kb）的不同靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，獲得大量等位突變體，通過(guò)篩選獲得高產(chǎn)突變株系，為作物產(chǎn)量數(shù)量性狀遺傳育種提供了新途徑。同樣，番茄控制單性結(jié)實(shí)的基因SlIAA9經(jīng)CRISPR/Cas9編輯后，突變體表現(xiàn)出單性結(jié)實(shí)、單葉等表型[67]。番茄慢成熟SlALC基因經(jīng)CRISPR/Cas9編輯后，突變體推遲了早熟及果實(shí)顏色變化，但并不影響成熟時(shí)間和成熟時(shí)的顏色[68]。SlMAPK3基因是番茄干旱脅迫響應(yīng)的正調(diào)控因子。經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，Simapk3突變體表現(xiàn)出葉子枯萎和莖彎曲等干旱敏感表型[69]。番茄SlPDS和SlPIF4經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，slpds突變體出現(xiàn)白化苗，而slpif4突變體表型沒(méi)有明顯改變，這可能與基因豐余有關(guān)[70]。

棉花（Gossypium hirsutum）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是由A和D 2個(gè)亞基因組組成的異源四倍體。GhMYB25-like基因?qū)γ藁ɡw維的發(fā)育具有重要調(diào)控功能。LI等[71]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和擬南芥PolⅢ啟動(dòng)子U6-26p和U6-29p，分別設(shè)計(jì)GhMYB25-like-sgRNA1及GhMYB25-likesgRNA2，獲得多個(gè)缺失/插入突變體。陸地棉的2個(gè)GhARG同源基因經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，抑制了精氨酸酶活性，但激活了一氧化氮合酶的活性，從而誘導(dǎo)精氨酸合成更多的一氧化氮（NO），最終促進(jìn)側(cè)根的形成[72]。棉花內(nèi)源性基因GhCLA1經(jīng)CRISPR/Cas9編輯后，75%的T0代植株呈現(xiàn)出白化苗表型[73]。而CHEN等[74]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)GhCLA1和液泡膜焦磷酸酶基因GhVP同時(shí)進(jìn)行編輯，成功獲得缺失/插入突變體（表1）。這些研究結(jié)果充分暗示，CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)對(duì)多倍體雙子葉植物也是行之有效的。

油菜（Brassica napus）是重要的含油種子作物。油菜與棉花都是異源四倍體作物，具有序列相似性的多基因拷貝數(shù)的特點(diǎn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，使油菜基因功能的研究和作物改良成為可能。而且，可借助一定的手段提高敲除效率，例如：從 特 定 網(wǎng) 站（http://cbi.hzau.edu.cn/crispr）獲 取sgRNAs、選取啟動(dòng)子和高GC含量，這些通常與高突變率相關(guān)[75]。在油菜作物中，由于基因的高拷貝性，致使一個(gè)基因家族的旁系同源基因常常具有功能豐余性，因此，單個(gè)基因的敲除并不能引起表型的變化。近年來(lái)，CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在油菜中的應(yīng)用報(bào)道較少，但也有突破性的進(jìn)展，如BARRTZ等[76]發(fā)現(xiàn)，BnALC基因與果莢瓣膜邊緣的發(fā)育有關(guān)，經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后，增強(qiáng)了抗破碎性，從而避免了機(jī)械收獲期間的種子損失。

4 展望

盡管CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良中具有傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但目前仍存在一些不足，尤其在多倍體作物中的實(shí)際應(yīng)用仍受到了一定限制。比如，多倍體結(jié)構(gòu)中基因組修飾特異性的降低，以及多基因組位點(diǎn)的高拷貝數(shù)均增加了脫靶的概率。因此，CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的脫靶事件引起了研究者的極大關(guān)注[77]。已有研究表明，人類(lèi)細(xì)胞的脫靶概率遠(yuǎn)比水稻和大豆高[78-79]。目前認(rèn)為非同源性重組的修復(fù)機(jī)制可能是造成脫靶現(xiàn)象發(fā)生的原因之一[80]，錯(cuò)配的位點(diǎn)大多發(fā)生在靶位點(diǎn)富含AT或A、T重復(fù)區(qū)域[64]。

目前的研究認(rèn)為，通過(guò)以下幾種策略可有效減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生：1）設(shè)計(jì)特異的sgRNA；2）改變Cas9核酸內(nèi)切酶的劑量與sgRNA的滴度；3）Cas9的任一功能結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變形成單鏈切割酶，2條sgRNA與Cas9切割酶發(fā)生互作；4）減少PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；5）改良CRISPR系統(tǒng)，如Cas9/RNP或Cpf1/RNP。在未來(lái)，Cpf1/RNP將被用作植物基因組編輯的另一種不引入外源DNA的新策略[81]。此外，最近的研究利用dCas9-TV系統(tǒng)也有效抑制了脫靶現(xiàn)象的發(fā)生[82]。

表1 CRISPR在主要作物中的應(yīng)用Table 1 Applications of CRISPR in staple crops

筆者堅(jiān)信通過(guò)對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas蛋白和sgRNA的不斷改進(jìn)，CRISPR/Cas編輯技術(shù)必將在作物遺傳改良、人類(lèi)基因治療等研究領(lǐng)域中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

:

[1] REYON D,KIRKPATRICK J R,SANDER J D,et al.ZFNGenome:A comprehensive resource for locating zinc finger nuclease target sites in model organisms.BMC Genomics,2011,12:83.

[2] WANG Y P,ZONG Y,GAO C X.Targeted mutagenesis in hexaploid bread wheat using the TALEN and CRISPR/Cas systems//BHALLA P L,SINGH M B.Wheat Biotechnology.New York,USA:Humana Press,2017:169-185.

[3]BOGDANOVE AJ,VOYTASDF.TALeffectors:Customizable proteins for DNA targeting.Science,2011,6051(333):1843-1846.

[4]CHATERJI S,AHN E H,KIM D H.CRISPR genome engineering for human pluripotent stem cell research.Theranostics,2017,7(18):4445-4469.

[5] LIU X J,ZHANG Y P,CHENG C,et al.CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells.Cell Research,2017,27(1):154-157.

[6] 劉海玲,王旭俊,李旦.CRISPR/Cas9高通量篩選技術(shù)與腫瘤治療.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2016,32(2):133-139.LIU H L,WANG X J,LI D.Application of CRISPR/Cas9 high-throughput screening technology for identifying new target in tumor therapy.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2016,32(2):133-139.(in Chinese with English abstract)

[7] 季彬,仇建萍,周宋峰,等.CRISPR/Cas9基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)在病毒性及遺傳性疾病治療中的應(yīng)用及其進(jìn)展.抗感染藥學(xué),2017,14(1):1-6.JI B,QIU J P,ZHOU S F,et al.Progress and application in CRISPR/Cas9 on treatment of human viral and hereditary diseases.Anti-Infect Pharmacy,2017,14(1):1-6.(in Chinese with English abstract)

[8]ISHINO Y,SHINAGAWA H,MAKINO K,et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli and identification of the gene product.Journal of Bacteriology,1987,169(12):5429-5433.

[9]JANSEN R,VAN EMBDEN J D A,GAASTRA W.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.Molecular Microbiology,2002,43(6):1565-1575.

[10]WEI C X,LIU J Y,YU Z S,et al.ALEN or Cas9-rapid,efficient and specific choices for genome modifications.Journal of Genetics and Genomics,2013,40(6):281-289.

[11]DEMIRCI Y,ZHANG B H,UNVER T.CRISPR/Cas9:An RNA-guided highly precise synthetic tool for plant genome editing.Journal of Cellular Physiology,2018,233(3):1844-1859.

[12]RATH D,AMLINGER L,RATH A,et al.The CRISPR-Cas immune system:Biology,mechanisms and applications.Biochimie,2015,117:119-128.

[13]MAKAROVA K S,WOLF Y I,ALKHNBASHI O S,et al.An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.Nature Reviews Microbiology,2015,13(11):722-736.

[14]HAFT D H,SELENGUT J,MONGODIN E F,et al.Aguild of 45 CRISPR-associated(Cas)protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.PLoS Computational Biology,2015,1(6):e60.

[15]DELTCHVA E,CHYLINSKI K,SHARMA C M,et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNaseⅢ.Nature,2011,471(7340):602-607.

[16]SHMAKOV S,ABUDAYYEH O O,MAKAROVA K S,et al.Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems.Molecular Cell,2015,60(3):385-397.

[17]KOONIN E V,MAKAROVA K S,ZHANG F.Diversity,classification and evolution of CRISPR-Cas systems.Current Opinion in Microbiology,2017,37:67-78.

[18]MAKAROVA K S,HAFT D H,BARRANGOU R,et al.Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.Nature Reviews Microbiology,2011,9(6):467-477.

[19]BRENDEL J,STOLL B,LANGE S J,et al.A complex of Cas proteins 5,6,and 7 is required for the biogenesis and stability of clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-derived RNAS(crRNAs)in Haloferax volcanii.Journal of Biological Chemistry,2014,289(10):7164-7177.

[20]FAGERLUND R D,WILKINSON M E,KLYKOV O,et al.Spacer capture and integration by a typeⅠ-F Cas1-Cas2-3 CRISPR adaptation complex.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2017,114(26):E5122-E5128.

[21]BURSTEIN D,HARRINGTON L B,STRUTT S C,et al.New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.Nature,2017,542(7640):237-241.

[22]NU?EZ J K,KRANZUSCH P J,NOESKE J,et al.Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPRCas adaptive immunity.Nature Structural&Molecular Biology,2014,21(6):528-534.

[23]SHAN Q W,WANG Y P,LI J,et al.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system.Nature Protocols,2014,9(10):2395-2410.

[24]CONG L,RAN F A,COX D,et al.Mutiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science,2013,339(6121):819-823.

[25]MIKAMI M,TOKI S,ENDO M.Precision targeted mutagenesis via Cas9 paired nickases in rice.Plant and Cell Physiology,2016,57(5):1058-1068.

[26]WU D,GUAN X Y,ZHU Y W,et al.Structural basis of stringent PAM recognition by CRISPR-C2c1 in complex with sgRNA.Cell Research,2017,27(5):705-708.

[27]WESTRA E R,SEMENOVA E,DATSENKO K A,et al.Type I-E CRISPR-cas systems discriminate target from non-target DNAthrough base pairing-independent PAM recognition.PLoS Genetics,2013,9(9):e1003742.

[28]JINEK M,CHYLINSKIK,FONFARA I,etal.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science,2012,337(6096):816-821.

[29]GEISINGER J M,TURAN S,HERNANDEZ S,et al.In vivo blunt-end cloning through CRISPR/Cas9-facilitated non-homologous end-joining.Nucleic Acids Research,2016,44(8):e76.

[30]MA X L,ZHU Q L,CHEN Y L,et al.CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants:Developments and applications.Molecular Plant,2016,9(7):961-974.

[31]SVITASHEV S,SCHWARTZ C,LENDERTS B,et al.Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.Nature Communications,2016,7:13274.

[32]SVITASHEV S,YOUNG J K,SCHWARTZ C,et al.Targeted mutagenesis,precise gene editing,and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA.Plant Physiology,2015,169(2):931-945.

[33]ZHANG H,ZHANG J S,WEI P L,et al.The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation.Plant Biotechnology Journal,2014,12(6):797-807.

[34]HYNES A P,LEMAY M L,TRUDEL L,et al.Detecting naturaladaptation of the Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas systems in research and classroom settings.Nature Protocols,2017,12(3):547-565.

[35]AMITAI G,SOREK R.CRISPR-Cas adaptation:Insights into the mechanism of action.Nature Reviews Microbiology,2016,14(2):67-76.

[36]JACKSON R N,WIEDENHEFT B.A conserved structural chassis for mounting versatile CRISPR RNA-guided immune responses.Molecular Cell,2015,58(5):722-728.

[37]SHA S A,ERDMANN S,MOJICA F J M.et al.Protospacer recognition motifs: Mixed identities and functional diversity.RNA Biology,2013,10(5):891-899.

[38]CHARPENTIER E,RICHTER H,VAN DER OOST J,et al.Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity.FEMS Microbiology Reviews,2015,39(3):428-441.

[39]YANG H,PATEL D J.New CRISPR-Cas systems discovered.Cell Research,2017,27(3):313-314.

[40]KLEINSTIVER B P,TSAI S Q,PREW M S,et al.Genomewide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells.Nature Biotechnology,2016,34(8):869-874.

[41]ZETSCHE B,GOOTENBERG J S,ABUDAYYEH O O,et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Transgenic Research,2016,25(2):207.

[42]MARESCAM,LIN V G,GUO N,et al.Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe):custom-designed nucleasemediated targeted integration through nonhomologous end joining.Genome Research,2013,23(3):539-546.

[43]YAMANO T,NISHIMASU H,ZETSCHE B,et al.Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.Cell,2016,165(4):949-962.

[44]LOWDER L G,ZHANG D W,BALTES N J,et al.A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation.Plant Physiology,2015,169(2):971-985.

[45]SHAN Q W,WANG Y P,LI J,et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.Nature Biotechnology,2013,31(8):686-688.

[46]MA X L,ZHANG Q Y,ZHU Q Y.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284.

[47]MIAO J,GUO D S,ZHANG J Z,et al.Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Research,2013,23(10):1233-1236.

[48]TANG L,MAO B G,LI Y K,et al.Knockout of OsNramp5 using the CRISPR/Cas9 system produces low Cdaccumulating indica rice withoutcompromising yield.Scientific Reports,2017,7:14438.

[49]YIN X J,BISWALAK,DIONORAJ,et al.CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 mediated targeting of a stomatal developmental gene EPFL9 in rice.Plant Cell Reports,2017,36(5):745-757.

[50]NIEVES-CORDONES M,MOHAMED S,TANOI K,et al.Production of low-Cs+rice plants by inactivation of the K+transporter OsHAK1 with the CRISPR-Cas system.The Plant Journal,2017,92(1):43-56.

[51]ZHOU J P,DENG K J,CHENG Y,et al.CRISPR-Cas9 based genome editing reveals new insights into microRNA function and regulation in rice.Frontiers in Plant Science,2017,8:1598.

[52]SáNCHEZ-LEóN S,GIL-HUMANES J,OZUNA C V,et al.Low-gluten,non-transgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9.Plant Biotechnology Journal,2017,16(4):902-910.

[53]MORRAN S,EINIO,PYVOVARENKO T,etal.Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors.Plant Biotechnology Journal,2011,9:230-249.

[54]ZHAO C Z,NIE H Z,SHEN Q J,et al.EDR1 physically interacts with MKK4/MKK5 and negatively regulates a MAP kinase cascade to modulate plant innate immunity.PLoS Genetics,2014,10(5):e1004389.

[55]ZHANG Y W,BAI Y,WU G H,et al.Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat.The Plant Journal,2017,91(4):714-724.

[56]WANG Y P,CHENG X,SHAN Q W,et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew.Nature Biotechnology,2014,32(9):947-951.

[57]UPADHYAY S K,KUMAR J,ALOK A,et al.RNA-guided genome editing for target gene mutations in wheat.G3:Genes,Genomes,Genetics,2013,3(12):2233-2238.

[58]SHI J R,GAO H R,WANG H R,et al.ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions.Plant Biotechnology Journal,2017,15(2):207-216.

[59]FENG C,YUAN J,WANG R,et al.Efficient targeted genome modification in maize using CRISPR/Cas9 system.Journal of Genetics and Genomics,2016,43(1):37-43.

[60]ZHU J J,SONG N,SON S L,et al.Efficiency and inheritance of targeted mutagenesis in maize using CRISPRCas9.Journal of Genetics and Genomics,2016,43(1):25-36.

[61]DU H Y,ZENG X R,ZHAO M,et al.Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9.Journal of Biotechnology,2016,217:90-97.

[62]LI Z S,LIU Z B,XING A Q,et al.Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean.Plant Physiology,2015,169(2):960-970.

[63]CHILCOAT D,LIU Z B,SANDER J.Use of CRISPR/Cas9 for crop improvement in maize and soybean.Progress in Molecular Biology and Translational Science,2017,149:27-46.

[64]KIM H,KIM S T,RYU J,et al.CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing.Nature Communications,2017,8:14406.

[65]XU C,LIBERATORE K L,MACALISTER C A,et al.A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.Nature Genetics,2015,47(7):784-792.

[66]RODRIGUEZ-LEAL D,LEMMON Z H,MAN J,et al.Engineering quantitative trait variation for crop improvement by genome editing.Cell,2017,171(2):470-480.

[67]UETA R,ABE C,WATANABE T,et al.Rapid breeding of parthenocarpic tomato plants using CRISPR/Cas9.Scientific Reports,2017,7:507.

[68]YU Q H,WANG B K,LI N,et al.CRISPR/Cas9-induced targeted mutagenesis and gene replacement to generate longshelf life tomato lines.Scientific Reports,2017,7:11874.

[69]WANG L,CHEN L,LI R,et al.Reduced drought tolerance by CRISPR/Cas9-mediated SlMAPK3 mutagenesis in tomato plants.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65(39):8674-8682.

[70]PAN C T,YE L,QIN L,et al.CRISPR/Cas9-mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations.Scientific Reports,2016,7:46916.

[71]LI C,UNVER T,ZHANG B H.A high-efficiency CRISPR/Cas9 system for targeted mutagenesis in cotton(Gossypium hirsutum L.).Scientific Reports,2017,7:43902.

[72]WANG Y L,MENG Z G,LIANG C Z,et al.Increased lateral root formation by CRISPR/Cas9-mediated editing of arginase genes in cotton.Science China Life Science,2017,60(5):524-527.

[73]WANG P C,ZHANG J,SUN L,et al.High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton(Gossypium hirsutum)using CRISPR/Cas9 system.Plant Biotechnology Journal,2018,16(1):137-150.

[74]CHEN X G,LU X K,SHU N,et al.Targeted mutagenesis in cotton(Gossypium hirsutum L.)using the CRISPR/Cas9 system.Scientific Reports,2017,7:44304.

[75]YANG H,WU J J,TANG T,et al.CRISPR/Cas9-mediated genome editing efficiently creates specific mutations at multiple loci using one sgRNA in Brassica napus.Scientific Reports,2017,8:4877.

[76]BRAATZ J,HARLOFF H J,MASCHER M,et al.CRISPRCas9 targeted mutagenesis leads to simultaneous modification of different homoeologous gene copies in polyploid oilseed rape(Brassica napus).Plant Physiology,2017,174(2):935-942.

[77]SCHAEFER K A,WU W H,COLGAN D F,et al.Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.Nature Methods,2017,14(6):547-548.

[78]FU Y F,FODEN J A,KHAYTER C,et al.High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology,2013,31(9):822-826.

[79]JACOBS T B,LAFAYETTE P R,SCHMITZ R J,et al.Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9.BMC Biotechnology,2015,15:16.

[80]KIM D,ALPTEKIN B,BUDAK H.CRISPR/Cas9 genome editing in wheat.Functional&Integrative Genomics,2018,18(1):31-41.

[81]KIM D,KIM J,HUR J K,et al.Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 nucleases in human cells.Nature Biotechnology,2016,34(8):863-868.

[82]LI Z X,ZHANG D D,XIONG X Y,et al.A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells.Nature Plants,2017,3(12):930-936.