袁慧雅，高利娜，劉國(guó)杰，徐恩宇，劉俊亭

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1. 法醫(yī)學(xué)院毒物分析教研室；2. 公共基礎(chǔ)學(xué)院化學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

1-甲基海因 （1-methylhydantoin，1-MH） 是五元含氮雜環(huán)內(nèi)源性小分子化合物，化學(xué)名1-甲基乙內(nèi)酰脲。 《中國(guó)藥典》 2015年版一部蛤蟆油項(xiàng)下將其作為鑒別指標(biāo)[1]。研究[2-7]表明1-MH作為乙內(nèi)酰脲類衍生物具有抗炎、消除活氧自由基、止咳平喘等藥理活性。有報(bào)道[8-9]青環(huán)海蛇、蟾蜍油和青蛙油中也檢測(cè)出1-MH，除蛤蟆油外，林蛙的其他部位也含有1-MH[10]。目前文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道多為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測(cè)1-MH，為進(jìn)一步研究具有相似功效動(dòng)物類中藥材與1-MH的關(guān)系以及1-MH的生成機(jī)制，本研究選取8種不同種屬的動(dòng)物類中藥材，在建立氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)合測(cè)定的基礎(chǔ)上研究1-MH的分布狀況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀 （美國(guó)Aglient公司） ；BT25S分析天平 （德國(guó)賽多利斯公司） ；S25渦旋振蕩器 （德國(guó)IKA公司） ；TG16K-Ⅱ高速離心機(jī) （長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司） 。1-MH （批號(hào)20151011） 購(gòu)自上海一研生物科技有限公司，純度>99.5%；普羅地芬 （內(nèi)標(biāo)，SKF-525A，批號(hào)1002181548） 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>98.0%，其他試劑均為色譜純。3批次的蛤蚧、蛤蟆油、烏蛇、海蛇、地龍、全蝎、阿膠、紫河車藥材均購(gòu)自北京同仁堂藥店，產(chǎn)地為安徽毫州，經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)劉俊亭教授鑒定為正品。

1.2 溶液制備

（1） 對(duì)照品溶液：精密稱取 1-MH 對(duì)照品適量，加甲醇溶液溶解并制成1.0 mg/mL 溶液。 （2） 內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取內(nèi)標(biāo)物SKF-525A對(duì)照品適量，加甲醇溶液溶解并制成100.0 ng/μ L溶液。 （3） 供試品溶液：解剖蛤蚧。分別取其頭部、脊椎骨、骨骼肌、四肢、皮膚、尾部適量稱重，粉碎至粉末狀，各取樣0.4 g置于具塞試管中，分別加入內(nèi)標(biāo)SKF-525A溶液5 μ L，加入0.01 mol/L鹽酸2 mL，超聲提取10 min，用2 mL乙酸乙酯震蕩提取3 min，3500 r/min離心10 min。吸取有機(jī)層，用氮?dú)獯蹈蓛x吹至100 μ L，用微量進(jìn)樣器吸取1 μ L進(jìn)GC-MS分析。烏蛇、海蛇、地龍、全蝎、阿膠、紫河車以及蛤蟆油樣品均按上述步驟處理。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

（1） 氣相色譜條件：采用HP-5ms （30 m×0.25 mm，0.25 μ m） 彈性石英毛細(xì)管柱。采用程序升溫：初始柱溫為60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至260℃，保持15 min，總計(jì)運(yùn)行26 min。進(jìn)樣口溫度為265℃，不分流進(jìn)樣1 μ L。載氣為高純氦氣 （99.9%） ，流速為1.0 mL/min。 （2） 質(zhì)譜條件：采用電子離子轟擊源 （EI源，70 eV） ，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，SIM掃描方式，溶劑延遲3 min。

2 結(jié)果

2.1 1-MH的圖譜認(rèn)證

氣相色譜-質(zhì)譜法分析以選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)荷比m/z114色譜圖中1-MH的峰面積和質(zhì)荷比m/z86色譜圖中SKF-525A的峰面積進(jìn)行計(jì)算，1-MH保留時(shí)間為6.9 min，質(zhì)荷比m/z114為分子離子峰，質(zhì)荷比m/z42為酰胺鍵斷裂后的碎片離子峰。均得到了良好的色譜響應(yīng)，見圖1。

圖1 1-MH的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.1 The chromatogram and mass spectrum of 1-MH

2.2 線性范圍與檢出限考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，并用甲醇稀釋成濃度為0.1、1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取1 μ L按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣分析。以1-MH與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo) （y） ，以1-MH濃度為橫坐標(biāo) （x） ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y= 9. 392x+ 6.6891 （r = 0.9992） ，在0.1～100.0 μ g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將最低濃度點(diǎn)繼續(xù)稀釋進(jìn)樣，按照3倍信噪比計(jì)算，檢出限為0.01 μ g/mL。

2.3 方法精密性與重復(fù)性考察

取濃度為10.0 μ g/mL的1-MH對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，每次進(jìn)樣1 μ L，記錄1-MH的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差 （relative standard deviation，RSD） 為1.1%，表明儀器精密度良好。精密稱取同一批哈蟆油樣品粉末 （約 0.4 g，過3號(hào)篩），共6份，分別加入1-MH對(duì)照品，制備成質(zhì)量濃度為10.0 μ g/mL的供試品粉末，按照樣品處理方法進(jìn)樣分析后得到1-MH峰面積的RSD為2.03 %。

2.4 方法準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批蛤蟆油樣品粉末 （約 0.4 g，過3號(hào)篩），共9份，分別加入1-MH對(duì)照品，制備成質(zhì)量濃度為1.0、10.0、100.0 μ g/mL的供試品粉末，每一質(zhì)量濃度制備3份，按“1.2”項(xiàng)下方法處理樣品，根據(jù)測(cè)得量和加入量 （1.0、10.0、100.0 μ g/mL） 1-MH計(jì)算3個(gè)濃度的平均加樣回收率分別為95.33%、98.42%、96.70%，RSD分別為0.6%、0.8%和 1.4%。

2.5 蛤蚧各組織中1-MH分布

根據(jù)蛤蚧解剖特點(diǎn)，各個(gè)組織部位相對(duì)分明，故分為5個(gè)部位分別測(cè)定，結(jié)果顯示，蛤蚧各部位均檢測(cè)出1-MH成分，和骨骼肌相關(guān)的組織含量均>1 μ g/g，而不含或較少含骨骼肌的組織<1 μ g/g。蛤蚧尾部1-MH含量超過身體其他部位10倍左右，見表1。

表1 蛤蚧各部位組織中1-MH的含量 （n = 3）Tab.1 Content of 1-MH in gecko tissues （n = 3）

2.6 動(dòng)物類中藥材1-MH分布

結(jié)果顯示，蛤蟆油、烏蛇、海蛇和蛤蚧中檢測(cè)1-MH分別為4.45、2.84、10.43、10.73 μ g/g，而地龍、全蝎、阿膠和紫河車樣品中未檢出1-MH。

3 討論

抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和平喘作用是蛤蟆油、烏蛇、海蛇、蛤蚧共有的藥理作用[13-16]，這幾種藥材均檢出了1-MH，與已有實(shí)驗(yàn)研究[2-7]的1-MH抗炎、消除活氧和自由基、止咳平喘等藥理活性相符合，推測(cè)1-MH可能為這幾種中藥材共同的藥效作用物質(zhì)之一。

蛤蚧尾部1-MH含量高于蛤蚧身體其他部位，這與傳統(tǒng)中醫(yī)注重使用蛤蚧尾部相吻合。《雷公炮炙論》中記載“凡使蛤蚧，毒在眼，勿傷尾也”[17]。《嶺表錄異》中有文“力在尾，不具者無功”[18]?，F(xiàn)代中藥藥理研究[19]表明無尾蛤蚧與尾全蛤蚧相比功效有所下降，價(jià)格也差別很大。

1-MH化學(xué)結(jié)構(gòu)與苯妥英類似，在不同pH條件下存在烯醇互變現(xiàn)象，堿性條件下主要以極性較大的內(nèi)酰亞胺形式存在，不利于有機(jī)溶劑提取。且堿性條件下酰胺鍵易發(fā)生水解開環(huán)降低提取率，故本實(shí)驗(yàn)采用強(qiáng)酸性條件（pH=2）提取，效果良好。

本實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)物類中藥材中1-MH含量，操作簡(jiǎn)便，方法檢出限、回收率、精密性等技術(shù)指標(biāo)均符合要求。1-MH是多種中藥材的共有成分，推測(cè)其可能為蛤蚧、烏蛇、海蛇和蛤蟆油的共同藥理活性物質(zhì)之一。本研究探索動(dòng)物類中藥材藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)國(guó)家中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化建立具有一定意義，同時(shí)為進(jìn)一步研究動(dòng)物體內(nèi)1-MH的生成機(jī)制提供參考。

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