鄺格靈，張 潔，孔德華，潘志輝，趙國(guó)忠*

（1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300308；3.廣州致美齋食品有限公司，廣東 廣州 510403）

食醋釀造歷史悠久，是一種以淀粉質(zhì)原料為主，通過(guò)微生物發(fā)酵釀造的酸性調(diào)味品。食醋不僅作為調(diào)味品，還有各種食療、保健作用（如軟化血管、調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防動(dòng)脈硬化、抗氧化、抗癌、降血壓、治療糖尿病等[1-3]）。我國(guó)食醋行業(yè)經(jīng)過(guò)上千年的不斷發(fā)展，已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。固態(tài)發(fā)酵食醋由于大多使用多菌種固態(tài)開(kāi)放式的發(fā)酵工藝，釀造微生物除了醋酸菌之外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等微生物的存在，不同微生物代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物不同，如醋酸菌可將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，構(gòu)成食醋的主體骨架；乳酸菌可以代謝產(chǎn)生乳酸，改善食醋的口感，同時(shí)包括乳酸在內(nèi)的眾多有機(jī)酸可以對(duì)乙酸起到緩沖作用，降低乙酸的刺激口感，使得食醋更加柔和。除此之外，芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等微生物在釀醋過(guò)程中代謝產(chǎn)生的眾多風(fēng)味物質(zhì)也可為食醋風(fēng)味的形成奠定基礎(chǔ)。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是一種常見(jiàn)于發(fā)酵制品中的乳酸菌，能定植于腸道發(fā)揮有益作用[4]。在食品發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌將食品原料中的糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，同時(shí)產(chǎn)生抗菌肽、胞外多糖和其他代謝產(chǎn)物[5]。不僅如此，乳酸菌還能夠產(chǎn)生水解蛋白質(zhì)的酶，將其水解為氨基酸，讓食醋的風(fēng)味變得更加醇厚和柔和[6]。除此之外，在乳酸菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中還能產(chǎn)生少量的乳酸鏈球菌素，能有效抑制雜菌及多種致病菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[7]。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類(lèi)好氧菌，可以通過(guò)三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑產(chǎn)生有機(jī)酸。這些有機(jī)酸不僅可以使食醋中的刺激酸味變得柔和，還可以通過(guò)酯化反應(yīng)與乙醇形成各酯類(lèi)，從而增加食醋的風(fēng)味。另外，它們還具有利用甘油產(chǎn)酸的能力，表明這些菌株具有多元醇的脫氫酶，此酶可將甘油脫氫產(chǎn)生具有淡薄的甜味的二羥基丙酮，讓食醋的香味變得更加濃厚[8]。此外，芽孢桿菌產(chǎn)生的大量蛋白酶可以將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，這些氨基酸對(duì)食醋的風(fēng)味和顏色起著至關(guān)重要的作用[9]。芽孢桿菌在食醋中的應(yīng)用研究較少，但是它卻是醋酸發(fā)酵中不可缺少的微生物類(lèi)群之一，在食醋釀造中，其對(duì)食醋的酸度、風(fēng)味的提高具有一定的作用[10]。呂艷歌等[11]采用16S rDNA序列分析法對(duì)山西老陳醋醋醅的產(chǎn)酸菌株進(jìn)行鑒定，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，醋醅中產(chǎn)酸菌主要以醋酸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌為主。本研究通過(guò)將植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）添加到食醋發(fā)酵體系當(dāng)中，采用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）研究其風(fēng)味物質(zhì)變化，進(jìn)而提高食醋的品質(zhì)，對(duì)于我國(guó)食醋工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia）、醋酸菌（acetic acid bacteria）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）：天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供。

山西老陳醋醋醅來(lái)源：采集于山西雙園醋業(yè)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

α-淀粉酶（5萬(wàn) U/g）、糖化酶（5萬(wàn)U/g）：河北亞信生物科技有限公司；三磷酸脫氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、TaqDNA聚合酶（250 U）：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[12-13]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，瓊脂18 g/L，pH 6.2～6.6。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本SHIMADZU有限公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)伯樂(lè) BIO-RAD公司；5424R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf有限公司；FE-20精密pH計(jì)、ME3002E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SP-250生化培養(yǎng)箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG-20離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；IKA VORTEX 1漩渦振蕩器：廣州易測(cè)儀器有限公司；DK-S12恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離鑒定

菌株的分離[14-15]：先取1 mL醋醅樣品加入9 mL滅過(guò)菌的生理鹽水中，然后依次做梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后用滅過(guò)菌的移液管吸取100 μL各濃度醋醅移至MRS培養(yǎng)基上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h后，觀察單菌落，挑取不同形態(tài)、大小的單菌落進(jìn)行劃線純化，3次分離純化之后，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并確定菌株形態(tài)，將鏡檢菌株接種在MRS液體培養(yǎng)基里于試管中進(jìn)行傳代培養(yǎng)到20代，置于4℃冰箱保存，備用。

菌株的鑒定：對(duì)篩選得到的乳酸菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，確定其種屬。將活化好的菌液進(jìn)行菌株的全基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取[16]，然后對(duì)基因組DNA的16S rDNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物27F序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增片段為1 500 bp。PCR體系50 μL：10×buffer 5 μL；脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）5 μL；上游引物（25 μmol/L）0.5 μL；下游引物（25μmol/L）0.5μL；TaqDNA聚合酶（250 U）0.5 μL；模板DNA 1.5μL；ddH2O37μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃、3min；95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min；72 ℃、5 min，2～4反應(yīng)步驟進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及濃度，將達(dá)到測(cè)序要求的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海華大基因進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上BLAST進(jìn)行比對(duì)，并確定其種屬。

1.3.2 食醋的固態(tài)發(fā)酵

①米粉液化糖化

食醋固態(tài)發(fā)酵參考文獻(xiàn)[17]。按照1∶2（g∶mL）的料水比將大米粉調(diào)成漿液，用碳酸鈉調(diào)節(jié)漿液pH值為6.4±0.1。按照100 U/g大米粉添加α-淀粉酶，90℃保溫液化20 min，然后降溫至（59±1）℃。用濃H2SO4調(diào)節(jié)pH值至4.5±0.1，按照100U/g大米粉添加糖化酶，60℃保溫糖化4h，糖化完成后，降溫至（36±1）℃，即為糖化液。

②酒精發(fā)酵階段

表1 酒精發(fā)酵階段植物乳桿菌和解淀粉芽孢桿菌添加量Table 1 Addition ofL.plantarumandB.amyloliquefaciensduring alcohol fermentation process

按照2%葡萄糖水溶液與安琪酵母粉1∶7的質(zhì)量比，將安琪酵母粉在30℃條件活化20 min，添加2%活化酵母液到糖化液中，再添加50%麩皮至糖化液中。添加L.plantarum和B.amyloliquefaciens菌液進(jìn)行酒精發(fā)酵，添加量見(jiàn)表1。在（30±1）℃條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為5 d。

③醋酸發(fā)酵階段

酒精發(fā)酵結(jié)束后，按照3%添加量添加活化好的醋酸菌，進(jìn)行醋酸發(fā)酵。醋酸發(fā)酵期間，每天分3個(gè)時(shí)間段（8：00am、1：00pm和5：00pm）觀察溫度計(jì)溫度的上升情況，當(dāng)溫度升至40℃時(shí)，需要進(jìn)行第一次攪拌，以后每天翻醅一次，控溫在42℃以下。攪拌數(shù)次后，醅料溫度下降至35～38℃，此間，利用酸堿中和的原理[18]，并以pH為指示終點(diǎn)每天測(cè)醋醅的酸度，當(dāng)酸度不再上升或稍有下降的時(shí)候，結(jié)束醋酸發(fā)酵。

1.3.3 食醋發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味成分分析

①樣品預(yù)處理

先將固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）萃取頭置于氣相色譜儀進(jìn)樣口處，于250℃條件下充分老化至沒(méi)有雜質(zhì)峰。準(zhǔn)確量取5 mL檢測(cè)醋樣置于15 mL的樣品瓶中，加入固體氯化鈉25 g，蓋上蓋子并將其置于40℃恒溫水浴中。將SPME萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，對(duì)樣品中的香氣成分吸附富集40 min后將SPME萃取頭從樣品瓶中拔出，插入GC-MS的氣相色譜進(jìn)樣口中，推出纖維頭，并于250℃條件下解吸2 min，準(zhǔn)備樣品檢測(cè)和分析。

②氣相色譜檢測(cè)條件

DB-170色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣（純度99.999%）；流量為1 mL/min；分流比5∶1，SPME萃取頭插入進(jìn)樣孔，溫度240℃解吸5 min。程序升溫：起始溫度35℃，保持30 min，以5℃/min的速度升至120℃，保持1min，再以10℃/min的速度升至220℃，保持2 min。

③質(zhì)譜測(cè)定條件

質(zhì)譜儀的接口溫度為280℃，離子源溫度為220℃，溶劑延遲時(shí)間1.5 min，電離方式為電子電離（electron ioniza tion，EI），電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍43～450 amu。通過(guò)HP-Chemstation System工作站采集和處理數(shù)據(jù)，先由譜庫(kù)初步鑒定成分，結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等進(jìn)行定性，采用面積歸一化法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌及芽孢桿菌的分離及鑒定

本研究從食醋醋醅樣品中分離得到18株菌，編號(hào)為C1～C18。采用16S rDNA序列分析法對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行序列分析，得到序列后在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其中3株菌為霉菌，另外15株細(xì)菌與NCBI上的物種相似度均＞98%。將該15株細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1所示，這18株菌分別鑒定為：乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus），副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。

圖1 菌株C1～C18 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strains C1-C18 16S rDNA

菌株分解淀粉的能力在食醋發(fā)酵行業(yè)起非常重要的作用，另外，由于食醋發(fā)酵屬于植物類(lèi)發(fā)酵，因此本實(shí)驗(yàn)選擇解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）C16和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C7為研究對(duì)象，其培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)描述見(jiàn)表2。由表2可知，菌株C7直徑大小約0.5 mm，邊緣平滑，凸起，呈乳白色。菌株C16直徑大小約2 mm，邊緣褶皺，不規(guī)則，半透明。

表2 菌株C7和C16菌落形態(tài)描述Table 2 Description of colony morphology of strain C7 and C16

2.2 食醋發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)分析

采用GC-MS分別對(duì)食醋的酒精發(fā)酵過(guò)程，醋酸發(fā)酵初期，醋酸發(fā)酵完成時(shí)樣品中的揮發(fā)性香氣成分變化進(jìn)行了分析。對(duì)空白對(duì)照組、3%C7、3%C16、2%C7+1%C16、1.5%C7+1.5%C16和1%C7+2%C16樣品中香味物質(zhì)總數(shù)和不同酒醅香味物質(zhì)類(lèi)型相對(duì)含量進(jìn)行比較分析。

2.2.1 酒精發(fā)酵階段風(fēng)味物質(zhì)分析

發(fā)酵至第5天時(shí)，酒精發(fā)酵已基本完成，取其樣品進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，分析其風(fēng)味物質(zhì)組成及含量，結(jié)果分別見(jiàn)表3和圖2。

由表3可知，對(duì)照組、3%C7、3%C16、2%C7+1%C16、1.5%C7+1.5%C16和1%C7+2%C16的樣品中香味物質(zhì)總數(shù)分別為31、31、30、38、35、29種。

表3 菌株C7和C19對(duì)醋醅風(fēng)味的影響Table 3 Effect of strain C7 and C19 on the flavor substances of vinegarPei

圖2 酒精發(fā)酵第5天六種不同醋醅風(fēng)味物質(zhì)類(lèi)型相對(duì)含量的比較Fig.2 Comparison of the relative contents of flavor substances in six types of vinegarPeion the fifth day of alcohol fermentation

由圖2可知，醋酸發(fā)酵初期，6個(gè)樣品風(fēng)味中占據(jù)主體地位的是酯類(lèi)，醇類(lèi)和醛類(lèi)，且3%C7的酯的相對(duì)含量是6個(gè)樣品中最高的，達(dá)到15.3%，而1%C7+2%C16的酯的相對(duì)含量最低，為11.75%；醇類(lèi)物質(zhì)含量最高的是2%C7+1%C16組，為8.93%，最低的是3%C7的樣品，為4.43%；醛類(lèi)物質(zhì)含量最高是添加1.5%C7+1.5%C16樣品，為4.01%，最低的是對(duì)照樣品，相對(duì)含量為0.74%。因此，在酒精發(fā)酵階段，相對(duì)高含量的植物乳桿菌在混菌體系中產(chǎn)生更多的酯類(lèi)和醇類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)。

2.2.2 醋酸發(fā)酵第1天風(fēng)味物質(zhì)分析

表4 菌株C7和C19對(duì)醋酸發(fā)酵開(kāi)始時(shí)風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 4 Effect of strain C7 and C19 on the flavor substances at the beginning of acetic fermentation

由表4可知，對(duì)照組、3%C7、3%C16、2%C7+1%C16、1.5%C7+1.5%C16和1%C7+2%C16的樣品中香味物質(zhì)總數(shù)分別為43、50、39、41、45、39種。

圖3 醋酸發(fā)酵第1天六種不同醋醅風(fēng)味物質(zhì)類(lèi)型相對(duì)含量的比較Fig.3 Comparison of the relative contents of flavor substances in six types of vinegarPeion the first day of acetic fermentation

由圖3可知，在醋酸發(fā)酵初期，6個(gè)樣品風(fēng)味中占據(jù)主體地位的是酯類(lèi)物質(zhì)，醇類(lèi)和酸類(lèi)，且3%C7中酯類(lèi)香味物質(zhì)相對(duì)含量最多，高達(dá)15.83%，而對(duì)照組酯類(lèi)香味物質(zhì)相對(duì)含量最少，僅為10.28%；醇類(lèi)物質(zhì)含量最高的是對(duì)照組，相對(duì)含量為7.78%，最低的是3%C16組，僅占3.54%；酸類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量最高的是對(duì)照組，占6.1%，最低的是1.5%C7+1.5%C16組，占3.6%。

2.2.3 醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)（醋酸發(fā)酵終止）風(fēng)味物質(zhì)分析

表5 菌株C7和C19對(duì)醋酸發(fā)酵終止時(shí)風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 5 Effect of strain C7 and C19 on the flavor substances at the end of acetic fermentation

由表5可知，醋酸發(fā)酵階段隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)明顯增多。對(duì)照組、3%C7、3%C16、2%C7+1%C16、1.5%C7+1.5%C16和1%C7+2%C16的樣品中香味物質(zhì)總數(shù)分別為45、49、50、47、54、46種。

由圖4可知，在醋酸發(fā)酵末期，除了對(duì)照組樣品風(fēng)味中占據(jù)主體位置的是酸類(lèi)以外，其余5個(gè)樣品風(fēng)味中占據(jù)主體地位的均是酯類(lèi)物質(zhì)。6個(gè)樣品中酯類(lèi)的相對(duì)含量最高的是3%C7組，占27.06%，最低的是對(duì)照組，酯類(lèi)物質(zhì)含量?jī)H占18.62%，主要是乙酸乙酯。酸類(lèi)的相對(duì)含量最高的是對(duì)照組，占26.62%，主要是乙酸，而最低的是1.5%C7+1.5%C16組，占17.26%；醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量最高的是1.5%C7+1.5%C16組，占10.75%，最低的是3%C16組，僅占4.51%；醛類(lèi)物質(zhì)含量最高的是3%C16的樣品，最低的是空白樣品。C7的添加，明顯提高了酯類(lèi)的種類(lèi)和含量。

3 結(jié)論

本研究從食醋醋醅中分離得到L.plantarum和B.amyloliquefaciens。利用這兩株菌與醋酸菌進(jìn)行多菌種固態(tài)發(fā)酵，利用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，在食醋發(fā)酵的混菌體系中，相較于空白對(duì)照組，其他組中香味物質(zhì)的總數(shù)都高于空白樣品，而當(dāng)添加1.5%植物乳桿菌和1.5%解淀粉芽孢桿菌時(shí)，可以得到最多數(shù)量的香味物質(zhì)（54種）和最高的醇類(lèi)物質(zhì)含量（10.75%），其中含量最高為3-甲基-1-丁醇（6.13%）；其他5個(gè)樣品酯類(lèi)物質(zhì)的含量也明顯高于空白樣品，當(dāng)添加3%植物乳桿菌的時(shí)候，可以得到最高的酯類(lèi)物質(zhì)含量（27.06%），主要是乙酸乙酯；當(dāng)添加3%解淀粉芽孢桿菌的時(shí)候，可以得到最高的醛類(lèi)物質(zhì)含量（3.05%），其中含量最高為苯甲醛（0.57%）。因此，該兩株菌有助于食醋風(fēng)味物質(zhì)的改善，擬為釀造風(fēng)味優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富的食醋提供理論依據(jù)。

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