付 博，段 杉，齊 明，陳嘉盛

（1.佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品系，廣東 佛山 528137；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

啤酒穩(wěn)定性研究是啤酒行業(yè)多年來(lái)的重要課題[1-3]。啤酒生產(chǎn)中添加合適的酶，可以穩(wěn)定或提高啤酒的質(zhì)量[4-6]，這使得越來(lái)越多的企業(yè)在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中添加各種酶制劑，但使用單一的酶來(lái)提高啤酒澄清度會(huì)因酶的專一性帶來(lái)一定的局限性[7-9]，如單一的酶澄清劑受酶高度專一特性的限制，難以解決啤酒因不同原因產(chǎn)生的渾濁、沉淀問(wèn)題[10]。而將單一酶制成復(fù)合酶制劑則可彌補(bǔ)各種酶的缺點(diǎn)，得到較好的效果[11-14]。因此，啤酒復(fù)合酶澄清劑將是啤酒澄清劑研發(fā)的重要方向，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)選定果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并在小試試驗(yàn)中研究了其用量對(duì)啤酒澄清度及pH、濁度、持泡性、色度的影響，從中選取對(duì)啤酒澄清度及其他質(zhì)量指標(biāo)提高最明顯的添加量，并在此基礎(chǔ)上利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶的用量進(jìn)行優(yōu)化，并以小試試驗(yàn)確定的復(fù)合酶澄清劑進(jìn)行中試試驗(yàn)，對(duì)啤酒質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)啤酒感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，以此驗(yàn)證其效果，旨在為配制啤酒復(fù)合酶澄清劑應(yīng)用于生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 啤酒生產(chǎn)原料

麥芽（澳大利亞）、啤酒花（捷克苦花、捷克香花）、法國(guó)S-189下面酵母酵母：市售。

1.1.2 酶制劑

木瓜蛋白酶（酶活80萬(wàn)U/g）、菠蘿蛋白酶（酶活50萬(wàn)U/g）、果膠酶（酶活20萬(wàn)U/g）、中性蛋白酶（酶活6萬(wàn)U/g）：鄭州萬(wàn)博化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限；PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；WGZ-2PJ濁度計(jì)：上海聽瑞儀器儀表有限公司；DV314C電子分析天平：美國(guó)奧豪斯公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 啤酒發(fā)酵條件

前發(fā)酵時(shí)間為4～5 d，發(fā)酵溫度為12℃；后發(fā)酵時(shí)間5～6 d，發(fā)酵溫度12℃；發(fā)酵完成后以雙層中速濾紙抽濾。

1.3.2 酶制劑的篩選

本試驗(yàn)根據(jù)酶制劑在啤酒澄清方面的研究報(bào)道[10]，以麥芽質(zhì)量計(jì)，分別研究木瓜蛋白酶（640 U/100 g）、果膠酶（800 U/100 g）、中性蛋白酶（90 U/100 g）、菠蘿蛋白酶（800 U/100 g）對(duì)啤酒的澄清效果；在麥汁糖化冷卻后，在4種小試樣中分別加入酶（以無(wú)菌冷水溶解酶粉后加入）后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，對(duì)啤酒的濁度、色度、pH、持泡性、感官指標(biāo)（包括色澤、香氣、泡沫、口感）進(jìn)行分析，確定其中3種澄清效果較好的酶制劑作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并通過(guò)單因素試驗(yàn)確定較好添加量。

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)連同響應(yīng)面法優(yōu)化3種酶的添加量以提高啤酒質(zhì)量。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 檢測(cè)方法

采用國(guó)標(biāo)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[15]測(cè)定啤酒的色度（分光光度計(jì)法）、濁度、持泡性（秒表法）、啤酒品質(zhì)感官評(píng)價(jià)、總酸（指示劑法）、酒精度（密度瓶法）；pH的測(cè)定[16]：用pH 4.00和pH 6.86的緩沖溶液校準(zhǔn)pH計(jì)后測(cè)定；α-氨基酸態(tài)氮測(cè)定[17]：茚三酮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑初步篩選結(jié)果

表2 添加各種酶對(duì)啤酒質(zhì)量的影響Table 2 Effect of adding various enzymes on beer quality

由表2可知，在加入各種酶制劑后，除加入中性蛋白酶的試樣濁度略微提高外，其他均有不同程度的降低，色度下降明顯，持泡性總體上略有提高；添加酶后發(fā)酵液pH值變化不大；除木瓜蛋白酶與原啤酒總體風(fēng)格不符外，其他3種酶對(duì)啤酒主要感官評(píng)價(jià)影響不大。因此，初步選擇果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶配制啤酒復(fù)合酶澄清劑，并進(jìn)一步研究其用量對(duì)啤酒澄清度和其他質(zhì)量指標(biāo)的影響。

2.2 果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶添加量對(duì)啤酒質(zhì)量的影響

由表3可知，添加720U/100g、760U/100g、800U/100g、840 U/100 g、880 U/100 g的果膠酶后，啤酒濁度均有不同程度的降低；色度下降明顯；持泡性總體上略有提高（添加760 U/100 g麥芽時(shí)略有降低）；發(fā)酵液pH值變化不大；果膠酶添加量為840 U/100 g時(shí)啤酒感官評(píng)分較高，因此選擇果膠酶添加量為800 U/100 g、840 U/100 g、880 U/100 g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 果膠酶添加量對(duì)啤酒質(zhì)量的影響Table 3 Effect of pectinase addition on beer quality

由表4可知，添加78 U/100 g、84 U/100 g、90 U/100 g、96 U/100 g、102 U/100 g的中性蛋白酶后，啤酒濁度除添加78 U/100 g有明顯下降外（下降幅度達(dá)到21.1%），其他添加量條件下均有所提高，但增幅均不明顯；色度下降明顯；持泡性有不同程度的提高；發(fā)酵液pH值變化不大；果膠酶添加量為78 U/100 g、84 U/100 g時(shí)，啤酒感官評(píng)分較高。綜合考慮啤酒的濁度、色度及感官評(píng)分，選擇中性蛋白酶添加量為78U/100g、84U/100g、90U/100g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表4 中性蛋白酶添加量對(duì)啤酒質(zhì)量的影響Table 4 Effect of neutral-protease addition on beer quality

由表5可知，添加600U/100 g、700 U/100 g、800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麥芽的菠蘿蛋白酶后，啤酒濁度除添加600 U/100 g麥芽時(shí)略有提高外，其他添加量均有不同程度的降低；色度下降明顯；持泡性有不同程度的提高；發(fā)酵液pH值變化不大；啤酒感官評(píng)分與對(duì)照相比波動(dòng)不大?？紤]到啤酒的濁度和色度是評(píng)價(jià)啤酒澄清度的最重要指標(biāo)，因此選擇菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表5 菠蘿蛋白酶添加量對(duì)啤酒質(zhì)量的影響Table 5 Effect of bromelain addition on beer quality

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化酶添加量

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)連同響應(yīng)面法優(yōu)化3種酶（X1果膠酶、X2中性蛋白酶、X3菠蘿蛋白酶）的添加量以提高啤酒質(zhì)量，即獲得pH值（Y1）波動(dòng)小、濁度（Y2）低、持泡性（Y3）好、色度（Y4）低的啤酒。

選擇Box-Behnken進(jìn)行3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到（15×3）的矩陣，一共15次試驗(yàn)；其中1～12號(hào)是析因試驗(yàn)，13～15號(hào)是中心試驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中分析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2和X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表6。

在以上試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式的響應(yīng)曲面分析（模型置信度取值為95%）；采用MATLAB 7.0作模型的平面預(yù)測(cè)線，得到啤酒質(zhì)量的響應(yīng)面參數(shù)。

表6 酶的添加量?jī)?yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments forenzyme addition optimization

麥汁質(zhì)量指標(biāo)與各種酶添加量之間的回歸方程如下：

2.4 外加酶對(duì)啤酒質(zhì)量指標(biāo)的影響

2.4.1 外加酶對(duì)啤酒發(fā)酵pH的影響

圖1 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對(duì)啤酒發(fā)酵pH值影響的響應(yīng)面和等高線Fig.1 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on pH value of beer

由圖1可知，3種酶的添加量對(duì)pH值的影響不顯著，即添加各種酶對(duì)發(fā)酵的pH沒有太大的影響?？紤]到在發(fā)酵過(guò)程pH相對(duì)穩(wěn)定對(duì)生產(chǎn)比較有利，因此得出，果膠酶添加量為820～860 U/100 g時(shí)較好；中性蛋白酶添加量為84～88 U/100 g時(shí)較好；菠蘿蛋白酶添加量為860～910 U/100 g時(shí)較好。說(shuō)明酶制劑對(duì)響啤酒發(fā)酵的pH環(huán)境影響很小。

2.4.2 外加酶對(duì)啤酒發(fā)酵濁度的影響

圖2 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對(duì)啤酒濁度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on turbidity of beer

由圖2可知，3種酶的添加對(duì)啤酒的濁度影響很顯著。濁度隨菠蘿蛋白酶添加量的提高而上升。同時(shí)，濁度也隨著中性蛋白酶添加量的增加呈現(xiàn)出總體上升的趨勢(shì)。而濁度隨著果膠酶添加量的提高而上升，而后有一種下降趨勢(shì)?？傮w而言，這3種酶對(duì)濁度的擬合較好，果膠酶添加量為800U/100g或880U/100g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g時(shí)均能找到最低濁度。

2.4.3 外加酶對(duì)啤酒發(fā)酵持泡性的影響

由圖3可知，持泡性受中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶的影響較明顯，受果膠酶的影響較弱。只要保證中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶的添加量在合適的范圍內(nèi)，持泡性就能保持在125 s以上?？紤]到持泡時(shí)間長(zhǎng)啤酒質(zhì)量較好，因此中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為880～905 U/100 g時(shí)持泡性最好，而果膠酶對(duì)持泡性的影響則可忽略。

圖3 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對(duì)啤酒發(fā)酵持泡性影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on foam-holding of beer

2.4.4 外加酶對(duì)啤酒色度的影響

圖4 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶交互作用對(duì)啤酒色度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on chroma of beer

由圖4可知，色度受酶添加量的影響十分顯著。三種酶對(duì)色度的擬合很好，在測(cè)定范圍內(nèi)均能找到最低的色度。果膠酶添加量為880 U/100 g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為840～880 U/100 g時(shí)啤酒色度達(dá)到最低。

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果的試驗(yàn)驗(yàn)證

確定酶的最優(yōu)添加量應(yīng)能保證啤酒發(fā)酵時(shí)的穩(wěn)定性，同時(shí)，為了保證啤酒產(chǎn)品的口感、風(fēng)味不受影響，因此添加酶制劑時(shí)要遵守盡量不加或盡量少加的原則，并且要考慮使用成本與添加效率之間的平衡。因此，在綜合考慮啤酒質(zhì)量指標(biāo)（特別是對(duì)啤酒澄清度有顯著影響的指標(biāo)：濁度）及添加酶制劑的原則后，進(jìn)一步確定了最佳添加量，即果膠酶添加量為880 U/100 g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g。而在此條件下，啤酒指標(biāo)理論值pH值為4.58，濁度為9.03 EBC，持泡性為144.3 s，色度為10.1 EBC。

為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)模型的準(zhǔn)確性，在以上最優(yōu)添加量下進(jìn)行了3次平行重復(fù)性發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表7。由表7可知，添加酶制劑后啤酒的pH值為4.58（提高0.2%），濁度為7.7 EBC（降低14.4%），持泡性為144s（提高102.8%），色度為9.9EBC（降低2.9%），總酸為0.34 mL/100 mL（未變化），酒精度為4.4%vol（提高7.3%），α-氨基酸態(tài)氮為181mg/L（提高15.3%），感官評(píng)分為84.67分（提高0.67%）。

表7 復(fù)合酶澄清劑對(duì)啤酒質(zhì)量的影響Table 7 Effect of compound enzyme clarifier on beer quality

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)酶篩選試驗(yàn)選取了果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其的添加量進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得出最優(yōu)酶的添加量為果膠酶880 U/100 g，中性蛋白酶78 U/100 g，菠蘿蛋白酶800 U/100 g。在此條件下，啤酒的濁度降低了14.4%，色度降低了2.9%，持泡性提高了102.8%，α-氨基酸態(tài)氮含量提高了15.3%。這種啤酒復(fù)合酶澄清劑的添加對(duì)啤酒的總酸、酒精度、pH值、感官評(píng)價(jià)沒有太大的影響，更重要的是啤酒濁度、色度均有下降，起到了較為明顯的澄清作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

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