李 琦，高健信，陳福生，李 牧*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.廣東科隆生物科技有限公司，廣東 江門(mén) 529100）

紅曲菌（Monascus）是一種絲狀真菌，能夠合成豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、莫納可林K、γ-氨基丁酸等，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)[1-4]。其中，紅曲色素作為一種天然微生物色素，以其穩(wěn)定性高、著色效果好、生產(chǎn)不受原料與季節(jié)限制等優(yōu)勢(shì)被用作食品著色劑，在我國(guó)與東南亞地區(qū)已有著近兩千年的應(yīng)用歷史[1]。紅曲色素是國(guó)內(nèi)增長(zhǎng)最快的食品著色劑品種之一，年產(chǎn)量已超過(guò)1萬(wàn)t。

1995年有學(xué)者[5]發(fā)現(xiàn)，某些紅曲菌株可以產(chǎn)生一種毒素—桔霉素，污染紅曲色素產(chǎn)品，使紅曲色素產(chǎn)品的安全性受到了挑戰(zhàn)。根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.181—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅》規(guī)定，紅曲紅單位色價(jià)的桔霉素含量≤0.04 mg/kg。因此，控制紅曲色素產(chǎn)品中桔霉素的含量成為紅曲色素工業(yè)中的重要課題。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)多種方法來(lái)控制紅曲色素產(chǎn)品中的桔霉素含量，并取得了一些重要進(jìn)展，主要包括低產(chǎn)桔霉素菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化以及基因工程改造。已有學(xué)者通過(guò)篩選獲得了低產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株[6]，此外，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件也能夠控制桔霉素含量，如控制發(fā)酵過(guò)程pH值[7]、通氧量[8]，以及利用低頻磁場(chǎng)也能夠抑制桔霉素的產(chǎn)生[9]。

近年來(lái)，隨著絲狀真菌基因組測(cè)序以及相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紅曲菌的分子生物學(xué)研究也取得了突破。桔霉素的生物合成途徑涉及16個(gè)基因[10]，其中聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）是合成桔霉素的第一個(gè)關(guān)鍵酶，有學(xué)者將紅色紅曲菌（Monascusruber）中的該基因敲除，發(fā)酵產(chǎn)物中桔霉素的含量降低了99%[11]。因此，通過(guò)基因工程構(gòu)建桔霉素合成基因的敲除菌株，能夠有效抑制桔霉素的合成，有利于紅曲色素的工業(yè)生產(chǎn)。

本研究在前期獲得了一株高產(chǎn)紅曲色素的紫色紅曲菌J01，在馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)13 d，色價(jià)可達(dá)到265 U/mL，高于目前已報(bào)道的大多數(shù)紅曲菌株[12]，但該菌株也能產(chǎn)生一定量的桔霉素。因此，本研究首先分析了菌株J01中桔霉素合成基因的轉(zhuǎn)錄情況，并采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移脫氧核糖核酸（transfer deoxyribonucleic acid，T-DNA）轉(zhuǎn)化技術(shù)敲除紫色紅曲菌（Monasucs purpureus）J01的桔霉素合成關(guān)鍵基因pksCT，構(gòu)建pksCT基因敲除菌株J42，并對(duì)其菌落形態(tài)、生物量、發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量與紅曲色素色價(jià)進(jìn)行了分析。期望能夠構(gòu)建具有工業(yè)應(yīng)用意義的不產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲色素的菌株，也為通過(guò)基因工程來(lái)改善絲狀真菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程提供了借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紫色紅曲菌（Monascus purpureus）J01、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 L，121 ℃濕熱滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加蒸餾水至1L，121℃濕熱滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

pSKH質(zhì)粒、雙元載體pCAMBIA3300質(zhì)粒：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏；限制性核酸內(nèi)切酶XhoI（10 U/mL）、SacI（10 U/mL）、HindIII（15 U/mL）：寶生物工程（大連）有限公司；TRIZOL：美國(guó)Invitrogen有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Tedia公司；桔霉素標(biāo)品（純度98%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；ACQUITY UPLCXevo TQ MS高效液相串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters公司；SHD-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZ200LB型搖床：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 桔霉素合成相關(guān)基因的克隆

參考紅曲菌公布的桔霉素合成基因的序列信息，采用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），由于pksCT基因有7 000 bp，直接擴(kuò)增錯(cuò)配率較高，因此將其分3段擴(kuò)增。

表1 桔霉素基因擴(kuò)增引物信息Table 1 Primers for citrinin gene amplification

按照參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法提取紫色紅曲菌J01的總核糖核酸（ribonucleicacid，RNA），以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementarydeoxyribonucleic acid，cDNA）。以cDNA為模板對(duì)桔霉素合成的相關(guān)基因進(jìn)行克隆，并對(duì)序列進(jìn)行分析。

1.3.2 桔霉素合成關(guān)鍵基因pksCT的序列分析

克隆得到pksCT基因送去測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用Softberry軟件預(yù)測(cè)紫色紅曲菌J01桔霉素合成基因簇中pksCT基因的結(jié)構(gòu)及其編碼的氨基酸序列。采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中的Blast功能對(duì)預(yù)測(cè)的基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。采用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam預(yù)測(cè)基因所編碼蛋白的活性結(jié)構(gòu)域。

1.3.3 桔霉素合成關(guān)鍵基因pksCT的敲除

通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)，使用表2中的引物對(duì)HygF/HygR克隆質(zhì)粒pSKH上的潮霉素B抗性基因hph，分別使用引物對(duì)CITF1/CITR1和CITF4/CITR4克隆紫色紅曲菌J01基因組中桔霉素編碼區(qū)的815bp上游同源臂（5'-UTR）和850 bp下游同源臂（3'-UTR）。通過(guò)重疊延伸PCR[14]技術(shù)，將3個(gè)片段進(jìn)行融合，即得到敲除盒。采用SacI和HindIII分別雙酶切敲除盒和雙元載體pCAMBIA3300，純化后的酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到敲除載體PC-CIT，將敲除載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105中，與紅曲菌J01孢子在28℃共培養(yǎng)3～10 d。

表2 本實(shí)驗(yàn)使用的引物Table 2 Primers used in this experiments

1.3.4 基因敲除菌株的篩選與驗(yàn)證

將基因敲除菌株接種到含有30 mg/L潮霉素的PDA平板上，28℃培養(yǎng)5 d，對(duì)菌株進(jìn)行初步篩選。提取初步篩選到的基因敲除菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別采用引物對(duì)HygF/HygR和orfF/orfRPCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因和orf基因片段，對(duì)基因敲除菌株進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 pksCT基因的Southern雜交驗(yàn)證

在37℃條件下，利用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI酶切菌株J01和J42的基因組12 h，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳10 h后轉(zhuǎn)移到Hybond+尼龍膜上，分別以hph基因（Probe 1）、pksCT基因的orf（Probe 2）作為探針在42℃條件下雜交16 h，進(jìn)行免疫檢測(cè)與顯色。

1.3.6 菌落形態(tài)觀察

將紅曲菌J01和菌株J42接種到PDA斜面上，7d之后洗下孢子，制備孢子懸浮液并且將孢子懸浮液濃縮到106個(gè)/mL，接種1μL到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)15d，觀察其菌落形態(tài)。

1.3.7 生物量測(cè)定

將菌株J01和J42按照1%（V/V）的接種量分別接種于40 mL PDB培養(yǎng)基中，于28℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵第15天時(shí)，將菌絲體和發(fā)酵液用濾布分離，并用蒸餾水多次洗滌菌絲體后將其轉(zhuǎn)移至已稱質(zhì)量的離心管中，冷凍干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算菌絲體干質(zhì)量。

1.3.8 桔霉素含量的測(cè)定

菌株的培養(yǎng)：按照1.3.7的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

桔霉素含量的測(cè)定：桔霉素的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.222—2016《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定》中的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行測(cè)定分析。為使測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，將上述樣品按照文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析。

1.3.9 紅曲色素色價(jià)的測(cè)定

菌株的培養(yǎng)：按照1.3.7的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

紅曲色素色價(jià)的測(cè)定：

（1）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：紅曲色素主要由黃、橙、紅三種類型的色素組成，各類色素對(duì)應(yīng)的最大光吸收波長(zhǎng)在380nm、470 nm和520 nm附近，因此，分別選取380 nm、470 nm和520 nm波長(zhǎng)處的吸光度值計(jì)算黃、橙、紅色素的色價(jià)。

（2）發(fā)酵液色素含量測(cè)定：用PDB培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵液，使其吸光度值在0.15～0.80范圍內(nèi)，分別測(cè)定波長(zhǎng)380 nm、470 nm、520 nm處的吸光度值，按色價(jià)計(jì)算公式分別計(jì)算發(fā)酵液中黃、橙、紅色素的色價(jià)。

（3）菌絲體色素含量測(cè)定：取冷凍干燥的菌絲體0.01g，采用液氮研磨破碎后裝入2mL的離心管中，加入1mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液，于60℃條件下水浴2h后，10000r/min離心5 min，取上清。用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液稀釋上清液，使其吸光度值在0.15～0.80范圍內(nèi)，分別測(cè)定上清液在波長(zhǎng)380 nm、470 nm、520 nm處的吸光度值，按色價(jià)計(jì)算公式分別計(jì)算菌絲體中黃、橙、紅色素的色價(jià)，其計(jì)算公式如下：

色價(jià)=A×總稀釋倍數(shù)。

式中：黃色素色價(jià)A為波長(zhǎng)380 nm處的吸光度值；橙色素色價(jià)A為波長(zhǎng)470 nm處的吸光度值；紅色素色價(jià)A為波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值。

（5）總色價(jià)：參考國(guó)標(biāo)GB 1886.19—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》中方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔霉素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

在基因敲除之前，首先需要驗(yàn)證潛在的目標(biāo)基因是否能轉(zhuǎn)錄。據(jù)報(bào)道，紅曲菌桔霉素合成基因簇包括16個(gè)基因，分別為MRL7、MRL6、MRL5、MRL4、MRL3、MRL2、MRL1、pksCT、MRR1、MRR2、MRR3、MRR4、MRR5、MRR6、MRR7、MRR8，這些基因依次參與桔霉素的生物合成過(guò)程，且該合成過(guò)程已經(jīng)基本清晰[10]，因此，需要對(duì)所有與桔霉素合成相關(guān)的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析其是否處于轉(zhuǎn)錄水平。以反轉(zhuǎn)錄得到的紫色紅曲菌J01的cDNA為模板，對(duì)紫色紅曲菌J01的桔霉素合成相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫色紅曲菌J01桔霉素合成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of citrinin-related syntetic genes fromM.purpureusJ01

由圖1可知，從紫色紅曲菌J01中克隆得到16個(gè)與桔霉素合成相關(guān)的基因，并且電泳條帶大小與表1預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明這些桔霉素合成相關(guān)基因處于轉(zhuǎn)錄水平。PCR產(chǎn)物送去（測(cè)序公司）測(cè)序，經(jīng)序列分析，結(jié)果表明，紫色紅曲菌J01來(lái)源的16個(gè)與桔霉素合成相關(guān)基因與目前公布的桔霉素合成基因序列基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明這些基因正常的參與桔霉素的合成，可被選擇為基因敲除對(duì)象。

2.2 紫色紅曲菌J01中pksCT基因的結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)目前報(bào)道的桔霉素生物合成途徑，pksCT基因編碼的蛋白為一種聚酮合酶（PKS），是合成桔霉素的關(guān)鍵酶，因此，分析了紫色紅曲菌J01中的pksCT基因。從J01菌株的cDNA中克隆得到pksCT基因，全長(zhǎng)共7 521 bp，編碼2 435個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道的紫色紅曲菌中控制桔霉素生物合成的PKS（GenBank：BAD44749.1）序列覆蓋度達(dá)100%，相似度為95%。

通過(guò)Pfam軟件預(yù)測(cè)pksCT蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，pksCT蛋白包含多個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，如起始單元?；d體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?；福╯tarter unit acyl carrier protein transacylase，SAT）、β-酮基合成酶（β-ketosynthase，KS）、酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、產(chǎn)物模板（product template，PT）、甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，CMeT）、酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）、還原酶（reductase，R）。聚酮合酶（PKS）中這些結(jié)構(gòu)域的功能各不相同，如：KS主要負(fù)責(zé)催化前體的縮合反應(yīng)，使得聚酮鏈得以延長(zhǎng)；AT主要負(fù)責(zé)前體的選擇；ACP主要負(fù)責(zé)前體和中間體的共價(jià)結(jié)合。聚酮合酶中KS、AT、ACP三個(gè)結(jié)構(gòu)域是絕大部分PKS功能所必須的[16]。因此，敲除的目標(biāo)基因片段至少要包括這三個(gè)部分，才能夠確保pksCT基因不再發(fā)揮功能。

圖2 pksCT蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of pksCT protein structural domain

2.3 桔霉素合成關(guān)鍵基因pksCT的敲除

采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用紅曲菌自身的同源重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)pksCT基因的敲除。首先通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證敲除載體是否轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3A。由圖3A可知，在農(nóng)桿菌中，存在5'-同源臂、hph抗性基因、3'-同源臂以及敲除盒的片段，并且條帶大小符合預(yù)期，說(shuō)明敲除載體成功轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌中。

圖3 pksCT基因敲除載體擴(kuò)增驗(yàn)證(A)及菌株J42的PCR擴(kuò)增結(jié)果(B)和Southern blot驗(yàn)證(C)Fig.3 Verification ofpksCTgene deletion cassette amplication(A)and PCR amplication results of strain J42(B)and Southern blot verification(C)

然后通PCR擴(kuò)增驗(yàn)證紫色紅曲菌中的pksCT基因是否被敲除，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3B，由圖3B可知，PCR擴(kuò)增得到了2.1 kb的唯一條帶，未擴(kuò)增到缺失的orf基因，因此，可以將該菌株初步鑒定為敲除菌株，命名為J42。

最后，進(jìn)一步對(duì)該基因敲除菌株進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證，結(jié)果如圖3C所示。由圖3C可知，以hph基因（Probe1）為探針，在敲除菌株中出現(xiàn)了單一雜交帶，而以orf基因（Probe2）為探針，則未出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明pksCT基因已被抗性基因hph替換，且hph以單拷貝的形式存在于菌株J42中，說(shuō)明菌株J42成功敲除pksCT基因。

2.4 基因敲除菌株與原始菌株的生長(zhǎng)情況比較

菌落形態(tài)比較：將原始紅曲菌株J01和基因工程菌株J42點(diǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)15 d，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株J42的菌落顏色呈橙黃色，菌落直徑為6.8 cm，與原始菌株J01相比，無(wú)明顯差異，說(shuō)明其生長(zhǎng)情況較為一致。

圖4 紫色紅曲菌株J01和J42菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology ofM.purpureusJ01 and J42

生物量比較：紅曲菌株J01和J42經(jīng)PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)15d，對(duì)菌絲體的生物量進(jìn)行測(cè)定。菌株J42生物量為4.43g/L，菌株J01的生物量為4.12g/L，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），進(jìn)一步說(shuō)明pksCT基因的缺失紅曲菌株的生長(zhǎng)無(wú)顯著性影響。

2.5 桔霉素含量及紅曲色素色價(jià)的測(cè)定

2.5.1 桔霉素含量的測(cè)定

采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測(cè)定菌株J01和J42菌絲體的桔霉素含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，紫色紅曲菌J01的桔霉素產(chǎn)量為5.1mg/kg。pksCT基因敲除后，菌株J42敲除菌株未檢出桔霉素，為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)樣品進(jìn)行了LC-MS/MS分析，其對(duì)桔霉素的檢出限為1.0 μg/kg，仍未檢測(cè)到桔霉素，并且在發(fā)酵液中也未檢測(cè)到桔霉素，說(shuō)明pksCT基因的缺失阻斷了桔霉素的合成，這與SHIMIZUT等[17-18]的研究結(jié)果一致。

圖5 紫色紅曲菌J01和J42桔霉素產(chǎn)量的HPLC分析結(jié)果Fig.5 HPLC analysis results of citrinin yield ofM.purpureusJ01 and J42

2.5.2 紅曲色素色價(jià)的測(cè)定

采用紫外分光光度法，分別測(cè)定了紫色紅曲菌J01和J42發(fā)酵液和菌絲體色價(jià)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在發(fā)酵液中（圖6A、6C、6E），菌株J42的色價(jià)分別為0.93 U/mL、0.31U/mL、0.24U/mL，較J01相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在菌絲體中（圖6B、6D、6F），菌株J42的黃色素、橙色素和紅色素色價(jià)分別為1 877 U/g、773 U/g、1 068 U/g，顯著高于菌株J01（P＜0.01），說(shuō)明pksCT基因的缺失不會(huì)降低菌株的產(chǎn)色素能力。從總色價(jià)來(lái)看，敲除菌株J42的總色價(jià)為415 U/mL，是原始菌株的1.56倍，分析原因可能是pksCT基因敲除后，用于合成桔霉素的大部分能量供給了色素合成，促進(jìn)了色素產(chǎn)量的提高。

圖6 紫色紅曲菌J01和J42菌株發(fā)酵液(A,C,E)和菌絲體(B,D,F)色價(jià)的比較Fig.6 Comparison of the color value in fermentation broth(A,C,E)and mycelium(B,D,F)ofM.purpureusJ01 and J42

3 結(jié)論

本研究在前期發(fā)現(xiàn)的一株高產(chǎn)紅曲色素的紫色紅曲菌J01基礎(chǔ)上，基于桔霉素合成基因序列測(cè)序與分析，依據(jù)桔霉素生物合成途徑，選擇聚酮合酶pksCT基因?yàn)榍贸龑?duì)象，通過(guò)基因工程方法成功將紫色紅曲菌J01基因組上的pksCT基因敲除，構(gòu)建工程菌株J42。通過(guò)菌落形態(tài)觀察和生物量的測(cè)定，得出菌株J42與原始菌株J01的菌落形態(tài)及生物量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。通過(guò)HPLC和LC-MS/MS檢測(cè)得出，菌株J42不產(chǎn)桔霉素，且紅曲色素總色價(jià)為415 U/mL，較原始菌株J01提高1.56倍。所以，本研究成功構(gòu)建一株不產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲色素的基因工程紅曲菌株J42。

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