單妍，王毅，吳麗君，馬永凱，宋鵬飛，魏云林

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南昆明 650106；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南昆明 653100；3.昆明理工大學(xué)生物工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650500）

烤煙葉片在大田生育過(guò)程中會(huì)有一定的淀粉積累，淀粉含量越高，反映煙葉越成熟。但在煙葉經(jīng)過(guò)陳化后，烤煙葉片內(nèi)大量的淀粉、纖維素、果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)將對(duì)煙葉成色質(zhì)量、煙絲成形質(zhì)量、卷煙吸食品質(zhì)具有較大的負(fù)面影響[1]。因此，降低陳化煙葉中的淀粉含量，勢(shì)必成為提高煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素。據(jù)報(bào)道，施加淀粉酶處理煙葉可使淀粉含量明顯降低[2-4]。李曉等[5]應(yīng)用混合酶制劑（糖化酶和α-淀粉酶）水解淀粉，淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖增加了20%左右，能有效降解原煙中大部分的淀粉，煙葉品質(zhì)得到了有效改善。因此，利用淀粉酶降解淀粉對(duì)于提高卷煙燃燒的完全性和燃吸時(shí)的氣味有積極的作用。雖然已有報(bào)道開(kāi)發(fā)出了能用于加速煙葉陳化的單一和復(fù)合酶制劑，并初步在工業(yè)上得到了驗(yàn)證，但依然存在酶性質(zhì)不清、產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)中許多因素不可控、生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題，同時(shí)由于原始菌株的長(zhǎng)期使用從而導(dǎo)致品種的嚴(yán)重退化，給規(guī)?；a(chǎn)帶來(lái)重重困難。為了徹底解決煙葉陳化用酶產(chǎn)率低，品質(zhì)不穩(wěn)定等技術(shù)難關(guān)，本課題篩選到陳化煙葉中的一株產(chǎn)淀粉酶菌株，鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行克隆與表達(dá)，達(dá)到利用淀粉酶高效降解淀粉以提高煙葉品質(zhì)的目的，同時(shí)為指導(dǎo)煙草用酶制劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種與質(zhì)粒

受體菌大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和質(zhì)粒pET30α都為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaq DNA聚合酶和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司，T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒及Ni-NTA購(gòu)自上海生工生物工程公司，其余選用的實(shí)驗(yàn)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 淀粉酶YX48-1菌株的篩選與鑒定

選取陳化煙葉樣品并進(jìn)行稀釋涂布，初步篩選到6株產(chǎn)淀粉酶菌株。以此為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定酶活在液體培養(yǎng)中復(fù)篩出1株高產(chǎn)淀粉酶的優(yōu)質(zhì)菌株，命名為AmyYX48-1。提取基因組DNA擴(kuò)增其16S rRNA片段，擴(kuò)增片段后測(cè)序參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]再進(jìn)行同源比對(duì)，可判斷待測(cè)菌的種屬類(lèi)別[7]。

2.2 YX48-1的全基因組測(cè)序及淀粉酶基因分析

根據(jù)文獻(xiàn)公布淀粉酶基因保守序列比對(duì)后，設(shè)計(jì)合成上下游引物，上游：5'- CGGGATCCATGTTTGCAAAACGATTCAAAA-3' ；下游：5'-CCCAAGCTTATGAGG AAGAGAACCGCTTA-3'。其中劃線(xiàn)部分即為加入的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)。再以高產(chǎn)淀粉酶菌株總DNA為模板，用ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸90s，循環(huán)30次；72℃補(bǔ)充延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上，將樣品通過(guò)Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序分析。

2.3 煙用產(chǎn)淀粉酶基因的克隆、表達(dá)及純化

2.3.1 煙用重組淀粉酶的質(zhì)粒構(gòu)建

將擴(kuò)增得到的目的片段連接已經(jīng)過(guò)雙酶切的表達(dá)載體pET-30a，得到重組質(zhì)粒pET。將重組質(zhì)粒pET轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3）中，經(jīng)Kan抗性篩選、菌落PCR篩選得到克隆菌株E.coli BL21-pET。

2.3.2 重組淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

把重組載體pETamyYX48-1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E .coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。將轉(zhuǎn)化子于37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，其OD值約為1.0。加入終濃度為1mmol/L的IPTG，16℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)12h。把培養(yǎng)好的發(fā)酵液高速離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體；重懸后在冰浴條件下超聲波破胞。當(dāng)菌液澄清時(shí)離心收集上清，對(duì)上清液金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化。利用SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)檢測(cè)純化效果及酶活性定性。

2.3.3 淀粉酶活性

將0.5mLpH6.8緩沖液配制的1%可溶性淀粉溶液作為底物，在37℃預(yù)熱2min后加入稀釋的酶液50μL，于37℃反應(yīng)5 min，然后加入350μL的DNS[8]煮沸5min終止其反應(yīng)。設(shè)定波長(zhǎng)540nm處測(cè)OD值來(lái)計(jì)算產(chǎn)生的還原糖量。本法規(guī)定淀粉酶活力單位（U）：在37℃ pH6.8條件下，每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（1U）。

3 結(jié)果與分析

3.1 淀粉酶YX48-1菌株的篩選與鑒定

根據(jù)菌落的形態(tài)與培養(yǎng)特征、生理與生化、提取基因組DNA擴(kuò)增其16SrRNA后鑒定結(jié)果在進(jìn)行同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus subtilis同源性達(dá)到95%，故初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

3.2 煙用重組淀粉酶的質(zhì)粒構(gòu)建

通過(guò)引物的設(shè)計(jì)，以篩選得到的產(chǎn)淀粉酶菌株總DNA為模版進(jìn)行克隆，凝膠電泳結(jié)果（圖1）所示，所得淀粉酶基因大小約為2000bp。雙酶切結(jié)果（圖2）都證明該基因已經(jīng)克隆到質(zhì)粒pET30α中（圖3），后測(cè)序結(jié)果顯示編碼區(qū)全長(zhǎng)1998bp，編碼665個(gè)氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量為73.12kD。

圖1 淀粉酶基因片段PCR產(chǎn)物

圖2 淀粉酶表達(dá)載體單雙酶切電泳驗(yàn)證圖

圖3 PCR檢測(cè)淀粉酶重組質(zhì)粒

3.3 重組載體在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

重組載體pET48-1在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)、純化后，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證分析，在分子量約為72kD處有明顯的特異條帶，如圖4所示。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)淀粉酶的表達(dá)

圖5 蛋白純化效果示意圖

3.4 重組淀粉酶活性

經(jīng)初步測(cè)定，采用DNS試劑法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)葡萄糖繪制吸光度-濃度曲線(xiàn)，37℃，pH7.0測(cè)定表達(dá)后結(jié)果顯示重組蛋白量較高，淀粉酶活力約為1700U/mL，相比于初始菌株酶活力擴(kuò)大10倍以上。

4 結(jié)論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枯草芽孢桿菌可從產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶微生物中發(fā)現(xiàn)[9]，本課題中結(jié)果也以此一致，本研究從烤煙葉片中取樣篩選鑒定出高產(chǎn)淀粉酶的菌株，以產(chǎn)淀粉酶菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行基因克隆及異源高效表達(dá)，解決了酶產(chǎn)量偏低、酶活性不高等問(wèn)題，將為以后規(guī)?；⒐I(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)煙葉奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

據(jù)研究，利用酶法降解烤煙內(nèi)淀粉含量的方法中，所采用的酶大多為外源酶[10]。本研究結(jié)果從煙葉本身能得到重組淀粉酶高效表達(dá)，隨之降解煙葉中淀粉，其優(yōu)越性在于淀粉來(lái)源于煙葉本身，這樣不但改善了煙葉的品質(zhì)，人們吸食的安全性也得到足夠的保障。后續(xù)，將針對(duì)所篩選的產(chǎn)淀粉酶微生物進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化、深入重組淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究等工作，將來(lái)為淀粉酶規(guī)?；?、工業(yè)化應(yīng)用于提高煙草制品的品質(zhì)提供了有力依據(jù)。

[1]王懷珠,楊煥文,郭紅英.烘烤過(guò)程中不同成熟度煙葉淀粉的降解動(dòng)態(tài)[J].煙草科技,2004,10(5):36.

[2]姚光明,閻克玉,李曉,等.烤煙中殘留淀粉的酶降解研究[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,15(3):25-27.

[3]李曉,劉風(fēng)珠,姜凌,等.淀粉類(lèi)酶在煙葉中降解條件的研究[J].生物技術(shù),2001,11(2):44-46.

[4]王懷珠,楊煥文,郭紅英.烘烤過(guò)程中外加淀粉類(lèi)酶對(duì)烤煙淀粉降解的影響[J].生物技術(shù),2004,14(5):67-69.

[5]李曉,劉風(fēng)珠,姜凌,等.淀粉類(lèi)酶在烤煙中降解條件的研究[J].生物技術(shù),2001,11(12):44-46.

[6]布坎R.E.,吉本斯NE.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984

[7]潘濤.一株酸α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選,發(fā)酵條件及基因克隆研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2010.

[8]Nanmori T, Nagai M, Shimizu Y, et al. Cloning of the Beta-amylase Gene from Bacillus Cereus and Characteristic of the Primary Structure of the Enzyme[J].Applied and Environmental Microbiolo gy,1993,59(2):623-627.

[9]姚光明.降低煙葉中蛋白質(zhì)含量的研究[J].煙草科技,2000,148(9):6-8.

[10]樊文舉,高娟娟,張建新.外源酶制劑對(duì)烤煙煙葉化學(xué)品質(zhì)的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,32(6):652-659.