李睿瑞 唐金敏 趙行建 婁旗輝 楊帆 韓如月 劉淑霞 荊瑞勇 王麗艷

摘 要：目的：優(yōu)化黑木耳中多糖的提取工藝條件，明確黑木耳多糖的抑菌活性。方法：采用單因素試驗和正交試驗，研究提取時的液料比、提取時間和提取溫度對黑木耳多糖提取率的影響。結(jié)果：提取溫度是影響黑木耳多糖提取率的最關(guān)鍵因素，其次是提取時間，液料比對多糖提取率的影響最小。結(jié)論：黑木耳多糖最佳提取條件為液料比30，提取時間4h，提取溫度95℃。在最佳提取條件下，黑木耳多糖提取率為5.16%。

關(guān)鍵詞：黑木耳；多糖；提取條件；正交試驗

中圖分類號 S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）11-0009-03

黑木耳[Auricularia auricular（L.ex Hook.） Underwrd.]又稱木耳，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），木耳目Auriculariales，木耳科Auriculariaceae[1]。中國是黑木耳的主要生產(chǎn)國，產(chǎn)區(qū)主要分布在吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、廣西、云南、貴州、四川、湖北、陜西等地，其中黑龍江省牡丹江地區(qū)海林市是中國最大的黑木耳基地，產(chǎn)出的黑木耳品質(zhì)在全國名列前茅[2]。目前國內(nèi)黑木耳有9個品種[3]，黑龍江地區(qū)有其中的8個品種。黑木耳多糖具有抗血栓[4]、抗凝血[5]、增強機體免疫功能[6]等多種有益于人體健康的功效，其含有豐富的甘露聚糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸等碳水化合物[7，8]，是菌中之佳品。本文利用正交試驗法，對黑木耳多糖的提取條件的優(yōu)化及粗多糖含量的測定進(jìn)行了研究。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料和試劑 供試黑木耳，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院食用菌研究室選育。將黑木耳用粉碎機粉成粉末狀態(tài)，過60目篩，保存?zhèn)溆?。葡萄糖、正丁醇、氯仿、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、活性炭等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器 V-1000型可見分光光度計（翱世儀器（上海）有限公司）、TDZ5-WS低速大容量離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、DK-8D三濕三控水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、AR153CN電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）、SZC-101智能型自動提取索氏提取器（上海纖檢儀器有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105℃下烘干至恒重的葡萄糖10mg，用蒸餾水溶解定容至100mL。精密吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞試管內(nèi)，補充蒸餾水至2.0mL，搖勻，另取1支具塞試管加入2.0mL蒸餾水作為對照。各試管加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，混合均勻，室溫放置25min，于490nm波長處測定吸光度。

2.2 黑木耳多糖的提取及純化 將黑木耳粉裝入濾紙包中，用SZC-101智能型自動提取索氏提取器除去脂肪，于40℃烘箱中烘干。稱取黑木耳粉1.00g，以0.3mol/L的NaOH溶液作為溶劑，采用不同的液料比、不同溫度、不同提取時間對黑木耳樣品進(jìn)行多糖的提取。完成浸提后于3000r/min離心10min，用5.0mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清液 pH至中性，濾液95℃下水浴濃縮至10mL，加入3倍體積的95%乙醇（30mL），靜置過夜。3000r/min離心10min，收集沉淀，加50mL水復(fù)溶后，取出20mL向其中加入5 mL sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩后靜置分離，直到?jīng)]有乳白色變性蛋白析出為止，收集分液漏斗中的上清液，向上清液中加入足量的活性炭，搖勻，恒溫30min以上，過濾；取0.05mL過濾液加蒸餾水至2mL，于490nm下進(jìn)行分光光度的測定。

2.3 多糖含量測定 黑木耳多糖含量測定采用苯酚-硫酸顯色法[9]，具體操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 單因素試驗設(shè)計 精確稱取樣品1.00g置于100mL三角瓶中，考察液料比對多糖得率的影響，液料比分別為10、20、30、40、50，提取溫度為85℃，提取時間為2h，提取1次，3次重復(fù)；考察提取時間對多糖得率的影響，提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h，液料比為30，提取溫度為85℃，提取1次，3次重復(fù)；考察提取溫度對多糖得率的影響，提取溫度分別為55℃、65℃、75℃、85℃、95℃，液料比為30，提取時間為2h，提取1次，3次重復(fù)，按照2.2方法操作。

2.5 正交試驗設(shè)計 擬采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化黑木耳多糖提取條件，根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選擇液料比、提取時間、提取溫度為影響因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗設(shè)計，見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按照2.1進(jìn)行實驗操作，以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，以A490為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；貧w方程：y=0.0064x+0.0106，R2=0.9955。

3.2 單因素試驗

3.2.1 液料比對黑木耳多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱量1.00g黑木耳干粉，液料比分別為10、20、30、40、50，提取溫度為85℃，提取時間為2h，提取1次，3次重復(fù)。按照2.2的方法進(jìn)行操作，結(jié)果見圖2。由圖2可知，黑木耳多糖提取率隨著液料比的增加而呈現(xiàn)先增加而后稍有下降的趨勢，液料比為30時多糖提取率達(dá)到最大值。從方差分析可知，當(dāng)液料比為30時多糖提取率與液料比40和50無顯著性差異，但顯著高于液料比20和10。因此選取液料比20、30和40進(jìn)行后續(xù)的正交試驗。

3.2.2 提取時間對黑木耳多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱量1.00g黑木耳干粉，提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h，液料比為30，提取溫度為85℃，提取1次，3次重復(fù)。按照2.2的方法進(jìn)行操作，結(jié)果見圖3。由圖3可知，黑木耳多糖提取率隨著提取時間的增加而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，提取時間為5h時達(dá)到最大值。從方差分析可知，提取時間為5h與4h時，多糖提取率之間無顯著性差異，與1h、2h和3h之間差異顯著。因此選取提取時間2h、3h和4h進(jìn)行后續(xù)的正交試驗。