董艷敏 劉滿宇 張文慧 張林波

摘 要：為克隆人生長(zhǎng)分化因子15基因，構(gòu)建hGDF15基因的重組原核表達(dá)載體，為研究該基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，利用PCR技術(shù)克隆其基因序列，將其分別連接至pET28a和pColdI載體，構(gòu)建重組pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表達(dá)載體，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切驗(yàn)證以及測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明：重組載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究hGDF15蛋白的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人生長(zhǎng)分化因子15；原核載體

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）11-0013-03

Abstract：For gene clone growth differentiation factor 15， constructing hGDF 15 gene recombinant prokaryotic expression vector， which laid the foundation for the study of the function of this gene， cloning the gene sequences using the PCR technology. Its connection to pET28a and pColdI carrier respectively， construct recombinant pET28a hGDF15 and pColdI hGDF15 prokaryotic expression vector， and verified plasmid PCR and double enzyme digestion and sequencing.The results show that the method of recombinant carrier is successful， which lays a foundation for further research on the mechanism of hGDF15 protein.

Key words：Human growth differentiation factor 15；Prokaryotic vector

糖尿病（Diabetes）是一類由遺傳、環(huán)境、免疫等因素引起的嚴(yán)重威脅人類生命健康的慢性代謝障礙性疾病，其基本病理特征為胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，或外周組織對(duì)胰島素敏感性的降低導(dǎo)致糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水及鹽代謝紊亂的一種疾病[1-3]。近幾年，全球糖尿病患病率逐年上升，預(yù)計(jì)到2030年，世界糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到4.39億[4-5]，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。目前，糖尿病分為Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、內(nèi)分泌性糖尿病、藥物或化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病、伴有其他遺傳綜合癥的糖尿病和妊娠期糖尿病等[6-7]。其中Ⅰ型糖尿病是因?yàn)棣录?xì)胞被破壞，致使胰島素的絕對(duì)不足。而Ⅱ型糖尿病是由于胰島素分泌相對(duì)不足產(chǎn)生的胰島素抵抗，這種類型糖尿病占患者總數(shù)的90%以上，主要表現(xiàn)為體型較肥胖，有口干、口渴等癥狀[8-10]。

人生長(zhǎng)分化因子15（human growth differentiation factor -15，hGDF15）是TGF-β超家族的成員之一，于1997年由Bootcov[11]等首次從人的骨髓單核細(xì)胞系統(tǒng)U937 cDNA文庫(kù)中被分離出來。目前，有大量證據(jù)表明hGDF15與肥胖及Ⅱ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系，如Kali[12]等研究比較GDF15的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠能更好地預(yù)防飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的肥胖且有更高的胰島素敏感性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的棕色脂肪中脂肪分解標(biāo)志物表達(dá)量增多。Macia[13]等對(duì)GDF15轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠血糖下降明顯，表明GDF15對(duì)葡萄糖耐受情況有所改善。Li[14]等用高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；推測(cè)出GDF15用負(fù)反饋的方式調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的活性氧簇表達(dá)，間接地改善胰島素抵抗的情況。隨著研究不斷深入，hGDF15可能為肥胖和糖尿病的治療帶來新的方向，為患者帶來福音。

本研究通過分子生物學(xué)手段，克隆hGDF15基因并構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，為下一步研究hGDF15在動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和主要試劑 原核表達(dá)載體pET28a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存、pColdⅠ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。限制性內(nèi)切酶NheⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ酶、T4 DNA ligase、10×T4 DNA ligase buffer、DL 2000 DNA Marker（TaKaRa）；質(zhì)粒提取試劑盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Sangon Bietech）。

1.2 方法

1.2.1 hGDF15基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank中公布的hGDF15基因序列，用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，如表1。

1.2.2 hGDF15基因的PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以攜帶hGDF-15成熟肽基因的原始質(zhì)粒為模板，以P1/P2和P3/P4為引物擴(kuò)增hGDF15基因，退火溫度分別為56℃、68℃，擴(kuò)增體系為P1/P2、P3/P4各1μL，模板1μL，ExTaq mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，56℃、68℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min，4℃保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，制備1%瓊脂糖凝膠，120V，電泳25min。

1.2.3 重組pET28a-hGDF15、pColdI-hGDF15載體構(gòu)建及驗(yàn)證 使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收純化的PCR產(chǎn)物與pET28a載體分別用NheⅠ、Hind Ⅲ雙酶切，PCR產(chǎn)物與pColdI載體分別用SacⅠ、Hind Ⅲ雙酶切，產(chǎn)物用Sangon Bietech試劑盒進(jìn)行純化回收。純化回收的基因與載體酶切產(chǎn)物連接，連接體系為T4 DNA ligase（350U/μL）1μL、10×T4 DNA Ligase buffer 1μL、pET28a 1.2μL、回收目的基因3.6μL、ddH2O 3.2μL，金屬浴16℃連接過夜，16h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化后將菌液分別涂布于含有卡那抗性、氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽(yáng)性單克隆菌落分別置于含卡那抗生素、氨芐抗生素LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，振蕩過夜。提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR及雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后送至上海生工測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 hGDF15基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的hGDF15基因，其片段長(zhǎng)度為339bp左右，目的基因產(chǎn)物條帶清晰，條帶與預(yù)期位置相一致（圖1、2）。

2.2 重組pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表達(dá)載體的鑒定 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，將2個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與目的基因大小相一致，且條帶單一無雜帶，重組原核表達(dá)載體驗(yàn)證成功后將其送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果與Genbank中和hGDF15的序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)DNAMAN Version5.2.2分析顯示，二者氨基酸序列相似性為100%，說明重組pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖3、4、5、6、7、8）。

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高，人們的飲食習(xí)慣發(fā)生著不合理的改變，各種代謝類疾病，如肥胖、高血脂癥和糖尿病的患病數(shù)量逐年增加，呈上升趨勢(shì)[15-17]。生長(zhǎng)分化因子15（GDF15）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族之一，其主要在巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[18-19]。作為一種新型脂肪細(xì)胞因子，GDF15具有抗炎、促進(jìn)氧化代謝、抑制食欲和減輕體重[20-21]的作用，能夠改善肥胖和糖耐量[22]，有望成為治療肥胖和Ⅱ型糖尿病的外周新靶點(diǎn)[23]。

pET28a載體為目前常用的原核表達(dá)載體，含有T7啟動(dòng)子以及多克隆位點(diǎn)，保證外源基因能夠在大腸桿菌中復(fù)制。同時(shí)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其易于操作、成本低廉、能夠大規(guī)?？焖偕a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。pColdI是Qing[24]等人利用冷休克基因cspA啟動(dòng)子開發(fā)了一系列獨(dú)特性的冷休克表達(dá)載體，當(dāng)溫度突然下降時(shí)，原核生物和真核生物表現(xiàn)出冷激反應(yīng)，通過合成冷休克蛋白來克服冷休克帶來的不利影響。在低溫下表達(dá)重組蛋白使大腸桿菌自身蛋白質(zhì)合成受到抑制，促進(jìn)目的蛋白正確折疊并增加蛋白質(zhì)的可溶性。二者有利于實(shí)驗(yàn)后期hGDF15蛋白的大量表達(dá)及純化。

為研究hGDF15蛋白在體內(nèi)的作用方式，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15重組原核表達(dá)載體，經(jīng)過質(zhì)粒PCR及質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究hGDF15蛋白在體內(nèi)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Ge Q， Chen L， Chen K. Treatment of Diabetes Mellitus Using iPS Cells and Spice Polyphenols[J].Journal of diabetes research， 2017， 2017（1）：5837804.

[2]Rao A A， Sridhar G R， Srinivas B， et al. Bioinformatics analysis of functional protein sequences reveals a role for brain-derived neurotrophic factor in obesity and type 2 diabetes mellitus[J]. Medical Hypotheses， 2008， 70（2）：424-429.

[3]Srikanth S， Deedwania P. Primary and Secondary Prevention Strategy for Cardiovascular Disease in Diabetes Mellitus[J].Cardiology Clinics， 2011， 29（1）：47-70.

[4]Mayer C，Bergholdt R， Cucak H， et al. Neutralizing Anti-IL20 Antibody Treatment Significantly Modulates Low Grade Inflammation without Affecting HbA1c in Type 2 Diabetic db/db Mice[J]. Plos One，2015，10（7）：e0131306.

[5]Bergman M， Buysschaert M， Schwarz P E， et al. Diabetes prevention： global health policy and perspectives from the ground[J]. Diabetes Management， 2012， 2（4）：309.

[6]柯玲玲. 糖尿病的分類[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)， 2016， 26（14）：204-205.

[7] Gonzalez J S， Peyrot M， Mccarl L A， et al. Depression and Diabetes Treatment Nonadherence：A Meta-Analysis[J].Diabetes Care， 2008， 31（12）：2398-2403.

[8]祝方， 紀(jì)立農(nóng)， 韓學(xué)堯，等. 短期胰島素強(qiáng)化治療誘導(dǎo)初診2型糖尿病患者血糖長(zhǎng)期良好控制的臨床試驗(yàn)[J].中國(guó)糖尿病雜志， 2003，11（1）：5-9.

[9]American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J].Diabetes Care，2011，34（Suppl 1）：62-69.

[10]葛均波， 徐永健. 內(nèi)科學(xué).第8版[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2013.

[11]Bootcov M R， Bauskin A R， Valenzuela S M， et al. MIC-1， a novel macrophage inhibitory cytokine， is a divergent member of the TGF-β superfamily[J].Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94（21）：11514-11519.

[12]Kali C， Wang X， Justin K， et al. NAG-1/GDF15 prevents obesity by increasing thermogenesis， lipolysis and oxidative metabolism[J].International Journal of Obesity， 2014， 38（12）：1555.

[13]Macia L， Tsai W W， Nguyen A D， et al. Macrophage Inhibitory Cytokine 1 （MIC-1/GDF15） Decreases Food Intake， Body Weight and Improves Glucose Tolerance in Mice on Normal & Obesogenic Diets[J]. Plos One， 2012，7（4）：e34868.

[14]Li J， Yang L， Qin W， et al. Adaptive induction of growth differentiation factor 15 attenuates endothelial cell apoptosis in response to high glucose stimulus[J].Plos One，2013，8（6）：e65549.

[15]Denicola E， Aburizaiza O S， Siddique A， et al. Obesity and public health in the Kingdom of Saudi Arabia[J].Reviews on Environmental Health， 2015， 30（3）：191-205.

[16]侯晅， 戴學(xué)文， 房志仲. 抗高血脂藥物的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)， 2016， 28（4）：59-64.

[17]鄧有珍， 白順軍. 2010—2015年某院住院糖尿病患者情況分析[J].中國(guó)醫(yī)院統(tǒng)計(jì)， 2016， 23（3）：230-231.

[18]Breit S N， Brown D A. TGF beta Superfamily Cytokine MIC-1/GDF15 in Health and Inflammatory Diseases[J].Compendium of Inflammatory Diseases，2016：1-13.

[19]Hyejin P， Chun-Ho K， Jae-Hoon J， et al. GDF15 contributes to radiation-induced senescence through the ROS-mediated p16 pathway in human endothelial cells [J].Oncotarget， 2016， 7（9）：9634-9644.

[20]Yang L， Chang C C， Sun Z， et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and is required for the anti-obesity effects of the ligand[J].Nature Medicine， 2017， 23（10）：1158.

[21]楊曦， 劉玉潔， 馬慧娟. 生長(zhǎng)分化因子15與肥胖及糖尿病[J]. 國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2016，36（6）：388-390.

[22]Chrysovergis K， Wang X， Kosak J， et al. NAG-1/GDF15 prevents obesity by increasing thermogenesis， lipolysis and oxidative metabolism[J].International Journal of Obesity， 2014， 38（12）：1555.

[23]Hsu J Y， Crawley S， Chen M， et al. Non-homeostatic body weight regulation through a brainstem-restricted receptor for GDF15.[J].Nature， 2017， 550（7675）：255-259.

[24]Qing G， Ma L ， Khorchid A ， et al. Cold-shock induced high2 yield protein production in Escherichia coli [J].Nature Bio-technology，2004，22：877.

（責(zé)編：王慧晴）