楊　棋，魏　薔，劉運超，馮　華，蔣大偉，陳玉梅，張改平*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

雞傳染性法氏囊病(IBD)最初在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)，該疾病是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一種急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病，危害世界所有主要的家禽產(chǎn)區(qū)[1-2]。IBDV是一種無囊膜的病毒，屬于Birnaviridae家族，基因組由A、B 2段雙鏈RNA組成。A節(jié)段包含2個部分重疊的開放閱讀框，其中較小的閱讀框編碼非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，較大的閱讀框編碼一個多聚蛋白[3]。多聚蛋白自裂解形成病毒蛋白VP2、VP3和VP4[4]，其中VP2和VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，為病毒核衣殼的主要成分。VP2含有血清型特異性并能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的構(gòu)象依賴型抗原決定簇,其誘導(dǎo)的中和抗體能被動地保護宿主不受 IBDV的感染，是 IBDV的保護性抗原，具有特異性[5]。研究表明，VP2與病毒毒力和細(xì)胞嗜性有關(guān)[6]。B節(jié)段主要編碼VP1蛋白，其是一種RNA依賴的RNA聚合酶[7-8]。

傳染性法氏囊病給家禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，目前尚無特效藥可以治療，主要應(yīng)用疫苗進行預(yù)防，所用疫苗主要為滅活疫苗和凍干活疫苗以及新型的基因工程亞單位疫苗[9]。其中，IBD基因工程亞單位疫苗具有較好的免疫原性，副作用相對較小，是一種應(yīng)用前景廣闊的禽病疫苗[10]。當(dāng)前IBD基因工程亞單位疫苗主要受困于重組蛋白的表達量以及生產(chǎn)成本等因素。原核表達系統(tǒng)具有操作簡便、生產(chǎn)成本低、實際應(yīng)用前景好等優(yōu)點，利用埃希氏大腸桿菌表達系統(tǒng)表達所得的VP2蛋白已經(jīng)被證明具有高度的免疫保護原性[11]。為了提高外源基因的表達水平、大量制備具有生物活性的目標(biāo)蛋白，長期以來研究人員嘗試優(yōu)化了表達菌株的生長溫度、培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)物濃度等[12]，但是VP2可溶性蛋白的表達量仍然有待進一步提高。為此，本研究通過廣泛篩選多種表達菌株，確定VP2蛋白的高效表達菌株，并測定了所表達VP2蛋白的免疫原性，為IBD新型基因工程亞單位疫苗的研究提供新的參考信息。

1　材料和方法

1.1　材料

原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存，IBDV B87株重組質(zhì)粒pUC57-VP2由上海生工生物工程有限公司合成，感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS購自北京華越洋生物科技限公司，Rosetta(DE3)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，雞傳染性法氏囊病抗原快速檢測試紙購自河南省百奧生物工程有限公司，His-Tag單抗購自Proteintech公司、羊抗鼠二抗購自Jackson公司，AEC酶底物試劑盒購自無錫傲銳東源生物科技有限公司，雞新城疫、傳染性法氏囊病二連滅活疫苗(La Sota株+HQ株)購自遼寧益康生物股份有限公司，IBDV標(biāo)準(zhǔn)強毒株 BC6/85和標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，陽性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室制備，SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2　VP2基因原核表達載體的構(gòu)建

將原核表達載體pET-28a(+)質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段；以重組質(zhì)粒pUC57-VP2中VP2的序列為模板進行PCR擴增，并將擴增的目的片段用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收VP2基因；二者連接后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，將陽性重組表達質(zhì)粒命名為pET28a-VP2。

1.3　重組VP2蛋白高效表達菌株的篩選

將1 μL重組質(zhì)粒pET28a-VP2分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取固體培養(yǎng)基平板上生長狀態(tài)良好的單克隆菌落，不同菌株各選取5個單菌落，然后誘導(dǎo)表達蛋白質(zhì)，活化菌體2～2.5 h，當(dāng)其OD600 nm值在0.6～0.9時，加入誘導(dǎo)劑IPTG,濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時間10 h，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)結(jié)束后12 000 r/min離心收集菌體，棄培養(yǎng)液。將收集到的菌體用PBS緩沖液重懸，并調(diào)節(jié)每種菌體濃度，然后使用分光光度計測量OD600 nm值，使其終值為1.8左右，最后將菌體懸浮液超聲破碎(振動頻率50 Hz，工作5 s間歇5 s，持續(xù)10 min)，破碎完成后分離收集上清(轉(zhuǎn)速12 000 r/min、4 ℃離心20 min)，棄沉淀。將IBDV VP2可溶性蛋白上清液100 μL倍比稀釋10、100、1 000、10 000倍，稀釋液選用PBS緩沖液，然后利用雞傳染性法氏囊病抗原快速檢測試紙檢測，鑒定每類菌株可溶性蛋白上清的最大顯色稀釋倍數(shù)，從而篩選出高效表達VP2蛋白的菌株。

1.4　重組VP2蛋白的表達驗證

將篩選到的高效表達菌株BL21(DE3)分別于18、30、37 ℃下誘導(dǎo)表達VP2蛋白，誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時間10 h,誘導(dǎo)結(jié)束后12 000 r/min離心收集菌體，棄培養(yǎng)液。將收集到的菌體用1/10體積的PBS緩沖液重懸，即1 mL PBS緩沖液重懸10 mL離心后收集到的菌體，將重懸后的菌體懸浮液超聲破碎(振動頻率50 Hz，工作5 s間歇5 s，持續(xù)10 min)，破碎完成后分離收集上清(轉(zhuǎn)速12 000 r/min、4 ℃離心20 min)，然后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western blot對VP2可溶性蛋白的表達進行驗證。

1.5　重組VP2蛋白的免疫原性分析

1.5.1瓊脂擴散試驗(AGP)檢測VP2蛋白效價制備瓊脂平板，中央孔滴加法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，將表達產(chǎn)物按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32、1∶64倍稀釋，周邊孔由高到低分別滴加稀釋蛋白液，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)抗原陽性對照和PBS陰性對照，抗原和血清加入量以加滿不溢出為度，樣品加畢后，將瓊脂平板加蓋平放于加蓋的濕盒內(nèi)，37 ℃溫箱中孵育24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5.2VP2蛋白的動物免疫將表達的VP2重組蛋白與ISA71佐劑混合乳化制備免疫原，同時設(shè)置商業(yè)疫苗和PBS對照組，進行SPF雞肌內(nèi)注射免疫，每組5只，試驗組免疫劑量為10 μg/只，商業(yè)疫苗0.3 mL/只，PBS組0.3 mL/只，并分別于免疫28 d后翅下靜脈采血，分離血清。

1.5.3免疫血清的AGP效價檢測制備瓊脂平板，中央孔滴加法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株(BC6/85)，將制備的血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32、1∶64倍稀釋，周邊孔由高到低分別滴加稀釋的血清抗體，并設(shè)置陽性對照組，加入量以加滿不溢出為度，樣品加畢后，將瓊脂平皿加蓋平放于加蓋的濕盒內(nèi)，37 ℃溫箱中孵育24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1　重組質(zhì)粒pET28a-VP2的酶切鑒定

從經(jīng)過活化的重組菌JM109(含pET28a-VP2)菌液中提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定。如圖1顯示，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到的目的片段及載體的大小分別與VP2片段和pET-28a(+)載體的理論大小一致，VP2約為1.4 kb，表明重組表達載體pET28a-VP2構(gòu)建成功，測序結(jié)果顯示重組載體中的VP2片段序列正確。

1：DNA Marker λ Hind Ⅲ； 2、3：pET28a-VP2雙酶切；

2.2　重組VP2蛋白的表達及高效菌株的篩選

如圖2所示，BL21(DE3)、Tuner(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可溶性上清樣品可以使雞傳染性法氏囊病快速檢測試紙條標(biāo)準(zhǔn)線和檢測線都顯色，因此判定為陽性；Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)上清樣品被檢測時只有標(biāo)準(zhǔn)線顯色而檢測線未能顯色，因此判定為陰性。試驗結(jié)果表明，BL21(DE3)、Tuner(DE3)pLysS可以誘導(dǎo)表達具有反應(yīng)原性的VP2蛋白，而Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)并不具備表達VP2蛋白的能力。將篩選出來的2種具有表達VP2蛋白能力的菌株進行誘導(dǎo)表達，重懸菌體，調(diào)整其OD600 nm=1.8，超聲破碎后的上清利用雞傳染性法氏囊病快速檢測試紙條檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BL21(DE3)表達的VP2可溶性蛋白上清在稀釋10、100、1 000倍時，試紙條檢測均呈陽性；Tuner(DE3)pLysS表達的VP2可溶性蛋白上清在稀釋10、100倍時，試紙條檢測呈陽性，增大稀釋倍數(shù)至1 000倍，便檢測不到呈陽性。

試驗結(jié)果表明，BL21(DE3)菌株具有高效表達VP2可溶性蛋白的能力，可作為候選的高效表達菌株進行誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化，從而提高VP2蛋白表達量。

1：BL21(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液；2：BL21(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液稀釋10倍；3：BL21(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液稀釋100倍；4：BL21(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液稀釋1 000倍；5：Tuner(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液；6：Tuner(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液稀釋10倍；7：Tuner(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液稀釋100倍；8：Tuner(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液；9：Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達蛋白破碎上清液

2.3　重組VP2蛋白的表達驗證

將誘導(dǎo)表達的VP2可溶性蛋白利用SDS-PAGE進行分析，如圖3所示，在約48 ku處出現(xiàn)一個條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。然后將SDA-PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以His-Tag單抗作為一抗，HRP標(biāo)記過的羊抗鼠IgG作為二抗，經(jīng)過AEC酶底物試劑盒顯色后，在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了一條特異性的抗原抗體反應(yīng)顯色條帶，證明表達的目的蛋白是VP2蛋白，并且具有較好的反應(yīng)原性。

1：彩虹180廣譜蛋白質(zhì)Marker； 2：37 ℃誘導(dǎo)；3：30 ℃誘導(dǎo)； 4：18 ℃誘導(dǎo)圖3　VP2可溶性蛋白的表達分析

2.4　重組VP2蛋白的免疫原性分析

2.4.1重組VP2蛋白的AGP效價檢測將表達所得的重組VP2蛋白利用AGP試驗分析，設(shè)置對照組，其中標(biāo)準(zhǔn)抗原陽性對照能檢測到沉淀線，PBS陰性對照未檢測到沉淀線，同時表達的VP2蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)形成沉淀線，并且將其進行1∶64稀釋時仍然能夠明顯地觀測到沉淀線(表1)，表明表達的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性，并且具有較高的表達量。

表1　重組VP2蛋白的AGP效價檢測

注：“++”表示沉淀線清晰可見,“+”表示可見，下同。

2.4.2免疫血清的AGP效價檢測將表達的VP2重組蛋白與ISA71佐劑混合乳化后制備免疫原，肌內(nèi)注射SPF雞進行免疫，分離的抗體血清進行AGP試驗鑒定。如表2顯示，商業(yè)疫苗組血清AGP效價可達1∶64，PBS組效價為0，而重組蛋白血清的AGP效價為1∶6，能檢測到沉淀線，表明誘導(dǎo)表達產(chǎn)物 VP2 蛋白可有效刺激雞體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答反應(yīng)并獲得較高的抗體水平。

表2　免疫血清的AGP效價檢測

注：“-”表示沉淀線不可見。

3　結(jié)論與討論

VP2蛋白構(gòu)成IBDV的外衣殼，約占病毒總蛋白質(zhì)的51%，是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白[2]，已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究。由于IBDV的毒力分子基礎(chǔ)和致病性分子標(biāo)志主要在VP2上[6]，因此VP2蛋白也是近年來IBDV新型亞單位疫苗研究的熱點。目前，IBDV主要宿主保護性抗原VP2蛋白已在大腸桿菌、酵母、真核細(xì)胞、病毒等多種表達系統(tǒng)中得到表達[13-16]。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng),具有培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、價格相對經(jīng)濟、生長培養(yǎng)速度快、可大量生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)等優(yōu)點[17]，是表達重組蛋白的首選宿主之一，目前已經(jīng)用來表達多種酶制劑和藥物制劑，市場上有40% 的重組制劑由大腸桿菌表達生產(chǎn)[18]。

本研究將構(gòu)建好的B87毒株 pET28a-VP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達，利用法氏囊病快速檢測試紙進行高效表達菌株的篩選，同時進行了VP2蛋白的表達鑒定，確定了BL21(DE3)作為VP2可溶性蛋白的高效表達菌株，然后進一步通過AGP試驗鑒定了重組VP2蛋白的反應(yīng)原性。目前對雞法氏囊病的診斷已有多種方法，經(jīng)典的檢測方法為AGP試驗，其次為酶聯(lián)免疫吸附試驗等[19]。經(jīng)AGP試驗鑒定，重組表達的VP2蛋白能夠和IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抗體結(jié)合發(fā)生反應(yīng)形成沉淀線，其AGP效價可達1∶64。據(jù)報道，國內(nèi)相關(guān)實驗室利用原核表達得到的VP2蛋白，AGP效價為1∶32[20]，這表明本研究獲得的重組VP2可溶性蛋白表達量較高，且具有良好的反應(yīng)原性。將表達的重組蛋白以肌內(nèi)注射方式接種試驗雞，對血清抗體進行AGP檢測，結(jié)果表明，其AGP效價不如商業(yè)疫苗組，達到1∶6，通過查閱相關(guān)文獻[21]可知，這一抗體水平可以實現(xiàn)對雞群的保護。因此，本研究表達的重組VP2蛋白可有效刺激雞體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，獲得較高的抗體水平，增強雞對IBDV的抵抗能力。