楊淑改，李曉燕，周勇

(1 平頂山學(xué)院，河南平頂山 467000；2平頂山市第二人民醫(yī)院；3新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院)

目前，臨床上對(duì)于乳腺癌的致病原因及具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但關(guān)于其治療仍是當(dāng)前腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，多種乳腺癌的治療方案逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，不同臨床特征的乳腺癌患者采取相應(yīng)的治療后可出現(xiàn)不同的預(yù)后。黑色素抗原基因(MAGE)多存在于正常人群的睪丸組織中[4]。有研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，MAGE在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)。MAGE-C1與MAGE-C2是MAGE家族中常見(jiàn)的兩種類(lèi)型，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，但關(guān)于其與乳腺癌的關(guān)系尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究回顧性分析84例乳腺癌患者的臨床及隨訪資料，旨在探討MAGE-C1與MAGE-C2在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取我院2008年5月～2012年5月收治的84例乳腺癌患者作為研究對(duì)象，患者均為女性，年齡35～70(52.36±9.42)歲?；颊呔邮苁中g(shù)治療，術(shù)中收集切取的乳腺癌癌變組織84例作為觀察組，并在手術(shù)過(guò)程中收集相應(yīng)距離癌組織邊緣5 cm以上且外觀正常的組織為對(duì)照組。按照1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)中乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，Ⅰ期14例、Ⅱ期48例、Ⅲ期22例。按照全國(guó)乳腺癌專(zhuān)業(yè)會(huì)議制定的病理分類(lèi)方案[8]，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌46例、浸潤(rùn)性小葉癌22例、乳腺髓樣癌16例。雌激素受體(ER)表達(dá)陰性52例、陽(yáng)性32例，孕激素受體(PR)表達(dá)陰性58例、陽(yáng)性26例，人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)表達(dá)陰性60例、陽(yáng)性24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2004年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的乳腺癌明確診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；在完善術(shù)前準(zhǔn)備后行手術(shù)治療且術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；所有患者知情同意本研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重肝腎功能不全者；除去乳腺癌外存在其他乳腺疾病及其他惡性腫瘤者；臨床及隨訪資料不完整者。

1.2MAGE-C1、MAGE-C2檢測(cè)方法①M(fèi)AGE-C1、MAGE-C2蛋白檢測(cè)。將所有組織標(biāo)本制成石蠟切片，按SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)所述的操作方法檢測(cè)MAGE-C1和MAGE-C2蛋白的表達(dá)。顯微鏡下觀察細(xì)胞染色棕黃色者為陽(yáng)性，呈顆粒狀或片狀，位于胞質(zhì)與胞膜[12,13]。參考Thaker依照細(xì)胞著色密度和著色強(qiáng)度建立以下半定量評(píng)分方法。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，每例切片至少評(píng)價(jià)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞。依陽(yáng)性細(xì)胞著色密度：陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為0～5%時(shí)為0分，>5%～50%為2分，>50%為3分。依陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：陰性為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，強(qiáng)染色為3分。將兩者相加，0分及著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為陰性，1～6分為陽(yáng)性。②MAGE-C1、MAGE-C2 mRNA檢測(cè)[11]。取2組組織，提取總RNA，合成cDNA，采用文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)引物序列擴(kuò)增PCR。取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL和溴酚藍(lán)上樣緩沖液2 μL，混合后上樣于2%的瓊脂糖凝膠(0.5 μg/mL溴化乙錠染色)加樣孔中，80 V電泳30 min，紫外透射反射儀下觀察條帶，凝膠圖像分析儀對(duì)目的基因(MAGE-C1與MAGE-C2)及內(nèi)參照基因(GAPDH)進(jìn)行積分吸光度分析并攝像。對(duì)比DNA Marker，擴(kuò)增出221 bp和325 bp的條帶為陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)參照基因?yàn)?01 bp條帶。MAGE-C1/GAPDH和MAGE-C2/GAPDH分別代表MAGE-C1和MAGE-C2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3預(yù)后隨訪方法所有患者出院后通過(guò)門(mén)診或電話等隨訪5年，隨訪終點(diǎn)為2017年5月30日或患者死亡。

2　結(jié)果

2.12組MAGE-C1、MAGE-C2表達(dá)比較觀察組、對(duì)照組MAGE-C1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.64±1.34、0.14±0.02，蛋白表達(dá)陽(yáng)性分別為54、8例，兩組相比P均<0.01。觀察組、對(duì)照組MAGE-C2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.50±1.30、0.10±0.01，蛋白表達(dá)陽(yáng)性分別為50、6例，兩組相比P均<0.01。

2.2不同臨床病理特征乳腺癌患者M(jìn)AGE-C1、MAGE-C2蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　不同臨床病理特征的乳腺癌患者M(jìn)AGE-C1、MAGE-C2蛋白表達(dá)比較(例)

2.3乳腺癌患者預(yù)后生存情況84例乳腺癌患者中，自出院至隨訪結(jié)束生存時(shí)間為1～54個(gè)月，中位生存時(shí)間為48.68個(gè)月，出院后1年生存率為94.05%(79/84)，3年生存率為89.29%(75/84)，5年生存率為78.57%(66/84)。

2.4MAGE-C1、MAGE-C2與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系MAGE-C1陰性和陽(yáng)性患者5年總生存率分別為93.33%(28/30)、70.37%(38/54)，MAGE-C2陰性和陽(yáng)性患者5年總生存率分別為88.24%(30/34)、72.00%(36/50)，兩者相比P均<0.05。非條件單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MAGE-C1陽(yáng)性、MAGE-C2陽(yáng)性的乳腺癌患者生存時(shí)間短(P均<0.05)，見(jiàn)表2。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MAGE-C1陽(yáng)性、MAGE-C2陽(yáng)性為影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表2　不同臨床病理特征乳腺癌患者生存時(shí)間比較(月)

3　討論

相關(guān)調(diào)查研究顯示，乳腺癌在女性人群發(fā)病率高，且好發(fā)于絕經(jīng)期前后婦女，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量[14,15]。目前，臨床上治療乳腺癌的主要有效手段為手術(shù)切除治療，但有研究發(fā)現(xiàn)，單純手術(shù)治療難以解決患者術(shù)后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問(wèn)題[16]。而除去治療方案外，有學(xué)者認(rèn)為機(jī)體相關(guān)細(xì)胞因子和基因的表達(dá)與術(shù)后治療效果及預(yù)后有著密不可分的關(guān)系，故尋找影響乳腺癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)因素并及時(shí)予以干預(yù)是改善乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵[17,18]。

MAGE-C1與MAGE-C2均屬于腫瘤睪丸抗原(CTA)中的成員，屬于兩種較為新型的腫瘤標(biāo)志物，其在正常人體僅存在于睪丸和胎盤(pán)組織中[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MAGE-C1與MAGE-C2最初被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞中，后不少?lài)?guó)內(nèi)外研究證實(shí)其在多種腫瘤細(xì)胞中均呈較高水平表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示，觀察組MAGE-C1、MAGE-C2 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)均高于對(duì)照組，結(jié)果符合既往報(bào)道。本研究結(jié)果還顯示，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER和HER2為陽(yáng)性的乳腺癌患者M(jìn)AGE-C1與MAGE-C2的陽(yáng)性表達(dá)率高。提示MAGE-C1與MAGE-C2在機(jī)體中的表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)生和疾病進(jìn)展有著密切聯(lián)系。目前，臨床上對(duì)于MAGE-C1與MAGE-C2在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的確切機(jī)制尚未完全闡明，但有研究表明，人類(lèi)體細(xì)胞中MAGE基因高度甲基化，而在胚胎細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中則可能發(fā)生去甲基化而獲得表達(dá)[21]；除此之外，MAGE-C1與MAGE-C2在瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)被降解成九肽或十肽，然后作為抗原表位，與細(xì)胞內(nèi)HLA分子結(jié)合后呈遞到細(xì)胞膜，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。Zhang等[22]給黑色素瘤患者接種MAGE抗原肽和Sadanaga等[23]采用MAGE抗原肽刺激DCs治療胃腸癌均具有一定的臨床效果。有研究[24]顯示，當(dāng)MAGE-A11在機(jī)體中呈現(xiàn)高水平表達(dá)時(shí)，可一定程度促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生，更進(jìn)一步提示MAGE與腫瘤有相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，HER2與乳腺癌的發(fā)生和疾病進(jìn)展及預(yù)后有一定的聯(lián)系，HER2陽(yáng)性表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后不良[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MAGE-C1陽(yáng)性、MAGE-C2陽(yáng)性患者生存時(shí)間短，表明MAGE-C1與MAGE-C2陽(yáng)性與乳腺癌患者預(yù)后有著一定的聯(lián)系。進(jìn)一步多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MAGE-C1陽(yáng)性、MAGE-C2陽(yáng)性均為影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)

表3　影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素分析

立危險(xiǎn)因素?？梢?jiàn)，MAGE-C1與MAGE-C2在乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后中起著重要的作用，可作為臨床上評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)。

綜上所述，MAGE-C1與MAGE-C2在乳腺癌組織中高表達(dá)，臨床分期為Ⅲ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER和HER2為陽(yáng)性時(shí)其均高表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后均不良。但本組研究所選樣本含量過(guò)小及研究時(shí)間過(guò)短，對(duì)于MAGE-C1與MAGE-C2的表達(dá)是否受其他因素影響尚未明確，可加大樣本量和延長(zhǎng)研究時(shí)間進(jìn)一步深入探討。