卯明霞　陸應(yīng)彩　彭　霞　姜明輝

(西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所，云南　景洪　666100 )

傣藥對(duì)葉豆葉傣語(yǔ)“芽拉勐龍” ，《西雙版納傣藥志第二集》也稱 “牙郎滿聾”、翅葉槐；《云南思茅中草藥選》以翅決明、翅果決明、非州木通收載，為豆科植物翅莢決明Cassia alata Linn.的干燥葉。傣醫(yī)臨床常外用[1]于治療神經(jīng)性皮炎，牛皮癬，溫疹，皮膚瘙癢，疔瘡腫瘍。文獻(xiàn)報(bào)道[2]含有:大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-3-(羥甲基)-O-β-葡萄糖苷、-生育酚、羽扇豆-20(29)-烯-3-酮、β-谷甾醇、2-乙基-3-甲基-馬來(lái)酸酐、鄰二甲氧基對(duì)羥基-E-肉桂酸、2,3-二乙酰基丁四醇等化學(xué)成分，未見對(duì)葉豆葉大黃酸含量測(cè)定的有關(guān)報(bào)道，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則[3]現(xiàn)建立對(duì)葉豆葉大黃酸含量測(cè)定方法，為對(duì)葉豆葉質(zhì)量評(píng)價(jià)傣醫(yī)臨床用藥提供參考方法和科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器Agilent高效液相色譜儀(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260QuatpumpVL)；島津UV-2550紫外可見光分光光度計(jì)；101-1EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；YB-1A真空恒溫干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司)；AE200電子分析天平(瑞士梅特勒)；BL310電子天平(德國(guó)賽多利斯)；MS205DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2試劑對(duì)照品大黃酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110757-201607)測(cè)定前在YB-1A真空恒溫干燥箱中以五氧化二磷干燥12h以上。乙腈、甲醇(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)為色譜純，水為超純水(自制)，其余試劑均為分析純。供試品對(duì)葉豆葉采自西雙版納州景洪市、勐?？h、勐臘縣。由西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為豆科植物翅莢決明(Cassia alata Linn.)的干燥葉。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性考察采用Waters Symmetry Shield RP18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液 (45 : 55)為流動(dòng)相；流速：1 mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；理論板數(shù)以大黃酸峰計(jì)不低于3000。色譜圖見圖1、圖2。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取大黃酸對(duì)照品適量(10.80mg)，置于200mL量瓶中，用甲醇制成每1mL含54μg的溶液，搖勻，即得；(注：大黃酸在甲醇中溶解度較小，因此本實(shí)驗(yàn)采用200mL的容量瓶，微加熱，即完全溶解)。

2.2.2供試品溶液的制備取供試品粉末0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，稱定重量，加熱回流1h(約70℃)，放至室溫，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察取濃度為54 μg / mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇配制成1.35，2.70，5.40，16.20，21.60，32.40，48.60，54.00μg /mL的對(duì)照品溶液，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL ，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，得回歸方程：Y = 22.063x + 0.1869 ( r2=0.9998)結(jié)果表明：大黃酸對(duì)照品進(jìn)樣量在1.35～ 54.00μg范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的對(duì)葉豆葉藥材(批號(hào)：20170820)6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，依次測(cè)定，對(duì)葉豆葉中大黃酸的平均含量為0.65mg/g，RSD為0.70%。

2.3.3精密度試驗(yàn)精密吸取大黃酸對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣7次，測(cè)得峰面積值的RSD為0.50%。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次(批號(hào)：20170820)的供試品溶液，分別在0，2，6，12，18，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，測(cè)得大黃酸峰面積的RSD為1.73%。表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的供試品(產(chǎn)地：西雙版納州景洪批號(hào)：20170820，含量：0.65mg/g)約0.25 g，平行6份，分別精密加入大黃酸對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法操作，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3　樣品測(cè)定

按照上述色譜條件，分別測(cè)定5個(gè)不同產(chǎn)地5批供試品，計(jì)算含量，見表2。

表2　不同產(chǎn)地、不同批次的對(duì)葉豆中大黃酸的含量(n=2)

4　討論

本研究采用二極管陣列檢測(cè)器及紫外分光度計(jì)在190～450nm波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在254nm、430nm處有最大吸收，文獻(xiàn)報(bào)道[4]及《中國(guó)藥典》2015年版一部大黃項(xiàng)下，大黃酸檢測(cè)波長(zhǎng)是430nm、 254nm，試驗(yàn)中在254nm波長(zhǎng)下的峰面積較大，但分離效果差，雜質(zhì)峰影響大，在430nm波長(zhǎng)下雜質(zhì)成分干擾小，大黃酸峰的分離度大于1.5，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為430nm；流動(dòng)相優(yōu)選時(shí)分別以乙腈-0.1%磷酸(45:55)、乙腈-0. 1%冰乙酸(70 : 30)、甲醇-0.1%磷酸(85 : 15)、乙腈-0.1%甲酸(80:20)為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果顯示以乙腈-0.1%磷酸(45 : 55)為流動(dòng)相，樣品分離度好，基線較穩(wěn)定，最終確定此流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)考察了如下幾種供試品處理方法：乙醇、水、甲醇為溶劑，采用回流提取(提取時(shí)間為60min、90min、120min)、超聲處理(超聲時(shí)間為30min、45min、60min)。試驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇為溶媒，回流提取60min對(duì)葉豆葉中大黃酸的含量較高，雜質(zhì)干擾少。

另參照中國(guó)藥典2015年版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”(通則9101)，考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)、不同色譜柱：Dikma Diamonsil Plus C18 (250×4.6mm, 5.0 μm)；Agilent ZORBOX SB- C18(150×4.6mm, 5.0 μm)；Waters Symmetry Shield RP18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；不同檢測(cè)波長(zhǎng)(430nm、427nm、433nm)；不同流速(0.8 mL/min、1mL/min 、1.2 mL/min)。結(jié)果顯示隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響較小，進(jìn)一步確保了試驗(yàn)方法的科學(xué)性及數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為對(duì)葉豆葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高提供科學(xué)依據(jù)。