李睿瑛朱維娜趙 敏譚妍妍陸 琴丁 康張?zhí)K閩

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江蘇南京210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江蘇南京210001）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）的發(fā)生發(fā)展與免疫、遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)，臨床常用藥主要為氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑以及微生態(tài)制劑等，部分藥物副作用明顯，且仍有一定復(fù)發(fā)率。中醫(yī)藥治療UC有內(nèi)服外用多種途徑，療效較好。丁氏潰結(jié)灌腸液是南京市中醫(yī)院肛腸科丁澤民教授根據(jù)祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方創(chuàng)制的，具有清熱利濕、行氣活血祛瘀、祛腐生肌等作用，臨床應(yīng)用以來，療效確切，患者依從性好[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，其可能通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的活性，減少炎癥因子，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)械屏障中的緊密連接蛋白（occludin）及免疫屏障中的免疫球蛋白A（IgA）的表達(dá)，抵抗葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的大鼠UC[2-3]。本研究將繼續(xù)利用DSS誘導(dǎo)制備UC模型大鼠，通過檢測(cè)藥物對(duì)髓過氧化酶（MPO）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA、脂質(zhì)過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，SPF級(jí)，8周齡，體重180～220g，雌雄各半，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 藥物 丁氏潰結(jié)灌腸液（藥物組成：金銀花、地榆、白及、復(fù)方珠黃散），由南京市中醫(yī)院制劑室制備。取白及粗末煎煮2次，金銀花、地榆煎煮2次，分別合并2次煎液，濾過，靜置，取上清液濃縮。取珠黃散加入白及膠漿調(diào)成糊狀后，加入金銀花、地榆濃縮液，最后加蒸餾水至全量，100℃流通蒸氣滅菌30min，即得。

1.3 試劑 葡聚糖硫酸鈉（DSS）購自美國MP公司，批號(hào)：MP16011090；Real-time PCR試劑盒套裝購于TaKaRa公司；ELISA試劑盒購于RayBiotech公司，批號(hào)：0513160728；美沙拉秦灌腸液由德國falk公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20100253；貝索BASO大便隱血（OB）試劑盒由南京市中醫(yī)院檢驗(yàn)科提供；PPAR-γ抗體購于Cell Signaling Technology。

1.4 儀器 電動(dòng)組織勻漿器，德國IKA T10；臺(tái)式低溫微量離心機(jī)，美國貝克曼Microfuge22R；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek Epoch；PCR反應(yīng)儀，美國ABI7500。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模、給藥 隨機(jī)選取8只大鼠作為空白組，其余大鼠使用DSS建立急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模組大鼠予3.5%DSS溶液自由飲用，連飲7d，大鼠出現(xiàn)腹瀉、便血、體重下降等癥狀視為造模成功，停飲DSS?？瞻捉M大鼠飲用純水。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、美沙拉秦灌腸液組（簡(jiǎn)稱美沙拉秦組）和潰結(jié)灌腸液低、中、高劑量組。各組飲水恢復(fù)正常，開始灌腸給藥。按非標(biāo)準(zhǔn)體重動(dòng)物的校正系數(shù)表[4]，人與大鼠換算系數(shù)為6.17，折算大鼠用藥量。潰結(jié)灌腸液低、中、高劑量組分別予1.5g/kg、3g/kg、6g/kg藥物灌腸，美沙拉秦組予美沙拉秦灌腸液2.4g/kg灌腸，灌腸量均為0.01mL/g，模型組給予等劑量生理鹽水灌腸，空白組不予灌腸處理。灌腸3d后，復(fù)飲4%DSS連續(xù)5d，邊飲DSS邊灌腸，5d后停飲DSS，再繼續(xù)灌腸治療6d，總灌腸療程為2周。

2.2 取材 治療結(jié)束后各組大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取距肛門上段2cm處結(jié)腸7～8cm，觀察結(jié)腸黏膜大體形態(tài)并評(píng)分。用4%中性多聚甲醛溶液固定，送南京市中醫(yī)院病理科，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，鏡下觀察并進(jìn)行病理評(píng)分。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般情況 造模及治療期間對(duì)大鼠進(jìn)行一般情況觀察，觀察指標(biāo)包括活動(dòng)度、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況（稀疏、倒毛等）、飲食量，參照Cooper等[5]的研究進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越高，炎癥程度越重，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），DAI=（體重下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+便血情況評(píng)分）/3。

2.3.2 結(jié)腸組織學(xué)觀察 大體評(píng)分參考Ekstr?m[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分，無損傷；1分，黏膜充血，水腫，無糜爛或潰瘍；2分，潰瘍形成，潰瘍面積≤受損面積25%；3分，潰瘍面積為受損面積25%～50%；4分，潰瘍面積≥受損面積50%。病理評(píng)分參照Dieleman等[7]標(biāo)準(zhǔn)。病變深度：0分，無病變；1分，病變侵及黏膜層；2分，病變侵及黏膜下層；3分，病變穿透黏膜。炎癥程度：0分，無炎癥；1分，輕；2分，中；3分，重。病變范圍：0分，無病變；1分，≤25%；2分，＞25%，≤50%；3分，＞50%，≤75%；4分＞75%。隱窩損傷：0分，無；1分，1/3隱窩損傷；2分，2/3隱窩損傷；3分，隱窩損傷，上皮表面完整；4分，隱窩損傷，上皮表面消失。

2.3.3 髓過氧化酶（MPO）測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]，取約150mg的末端結(jié)腸組織，懸浮在0.5%的溴化十六烷基三甲基（50mmol/L磷酸鉀）pH6.0緩沖液中，制成10%勻漿液，勻漿10min，勻漿反復(fù)凍融3次，12000r/min、12min、4℃離心，取上清0.1mL加2.9mL O-Dianisidine（含0.0005%H2O2）。在460nm處測(cè)定3min，計(jì)算每分鐘吸光度的變化（ΔA460/min）。25℃時(shí)每分鐘分解1μmol過氧化物的量就定義為一個(gè)酶活性單位（U），根據(jù)公式計(jì)算MPO活力。MPO活 力（U/mg組 織）=[ΔA460/（1.13×10-2）]/0.7，取3min的平均值。

2.3.4 ELISA法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α含量 按照說明書操作。

2.3.5 Real-Time PCR方法檢測(cè)結(jié)腸組織iNOS mRNA表達(dá)水平 取少量?jī)龃娼Y(jié)腸組織，研碎，加1mL Trizol溶液，按說明書提取結(jié)腸組織RNA，測(cè)定純度，取樣品5μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取待測(cè)樣品cDNA按說明書配制成總體 積 為20μL的RT-PCR反 應(yīng) 體 系，PCR反 應(yīng) 儀95℃、30s，95℃、15s，60℃、60s，進(jìn)行循環(huán)40次，退火溫度60℃。以β-actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參正向序列GGAAATCGTGCGTGATATTA，反向序列GGAGCAATGATCTTGATCTTC；目 的 基 因iNOS正向序列AAGAGACGCACAGGCAGAGG，反向序列AGCAGGCACACGCAATGATG。所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，相對(duì)定量，SYBR Green，選用2-△△Ct法。

2.3.6 免疫組化法觀察結(jié)腸黏膜PPAR-γ 按照博士德免疫組化石蠟切片熱修復(fù)抗原染色程序說明書操作，其中一抗稀釋倍數(shù)（兔IgG∶PPAR-γ抗體為1∶500）。應(yīng)用Image-ProPlus 6.0圖像采集軟件采集圖像，在高倍鏡（×100）下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)具代表性的視野，選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值IOD/area（density mean），應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合條件者用單因素方差分析檢驗(yàn)總體均數(shù)差異性，不符合者用非參數(shù)檢驗(yàn)，用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析總體差異，再進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換后，使用S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況及DAI評(píng)分比較 空白組反應(yīng)敏捷，活潑好動(dòng)，毛色光澤，大便正常，飲水及進(jìn)食量正常，體重逐漸增加。造模組在實(shí)驗(yàn)過程中逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、活動(dòng)量減少、扎堆、弓背等情況，進(jìn)食和飲水量減少，體重增加不明顯。各組DAI評(píng)分比較見表1。治療后丁氏潰結(jié)灌腸液各劑量組間DAI評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），丁氏潰結(jié)灌腸液中高劑量改善DAI評(píng)分的療效與美沙拉秦相當(dāng)。

3.2 各組大鼠治療后結(jié)腸黏膜評(píng)分比較 模型組結(jié)腸黏膜可見不同程度的充血和水腫，腸壁黏膜可見散在的潰瘍?cè)詈兔訝€出血點(diǎn)，伴有大量炎細(xì)胞浸潤，大體評(píng)分與病理評(píng)分明顯高于空白組（P＜0.05，P＜0.01）。丁氏潰結(jié)灌腸液各劑量組和美沙拉秦組大鼠結(jié)腸黏膜病變明顯好轉(zhuǎn)，大體評(píng)分與病理評(píng)分明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；丁氏潰結(jié)灌腸液各劑量組組間無明顯差異（P＞0.05）；丁氏潰結(jié)灌腸液中高劑量對(duì)黏膜損傷修復(fù)效果與美沙拉秦相當(dāng)。見表2。

3.3 各組大鼠治療后MPO、IL-6、TNF-α、iNOS mRNA、PPAR-γ表達(dá)比較 結(jié)果見表3、表4、圖1。MPO、IL-6、TNF-α含量在丁氏潰結(jié)灌腸液各劑量組組間無明顯差異（P＞0.05），而丁氏潰結(jié)灌腸液高劑量組iNOS mRNA表達(dá)明顯低于低劑量組（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表達(dá)量明顯高于低劑量組（P＜0.01）。在對(duì)MPO、IL-6含 量 以 及iNOS mRNA、PPAR-γ蛋白表達(dá)的改善方面，丁氏潰結(jié)灌腸液高劑量與美沙拉秦相當(dāng)。

表1 各組大鼠不同時(shí)期DAI得分比較 分

表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜大體評(píng)分與病理評(píng)分比較 分

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織MPO、IL-6、TNF-α含量比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織MPO、IL-6、TNF-α含量比較（±s）

注： 與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與模型組比較，**P＜0.01 ；與美沙拉秦組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量（g/kg） MPO（U/mg） IL-6（pg/mg） TNF-α（pg/mg）空白組 8 0.073±0.014 0.150±0.340 9.372±1.565模型組 8 0.217±0.027##0.453±0.063##19.661±2.219##美沙拉秦組 8 2.4 0.098±0.016**0.272±0.040**##11.131±1.742**丁氏潰結(jié)灌腸液低劑量組 8 1.5 0.134±0.057**#☆☆0.298±0.058**##15.647±2.385**##☆☆丁氏潰結(jié)灌腸液中劑量組 8 3 0.129±0.022**##☆☆0.280±0.040**##15.674±3.829**##☆☆丁氏潰結(jié)灌腸液高劑量組 8 6 0.110±0.040**##0.250±0.063**##14.755±1.708**##☆☆

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織iNOS基因、PPAR-γ蛋白表達(dá)量（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織iNOS基因、PPAR-γ蛋白表達(dá)量（±s）

注： 與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與模型組比較，**P＜0.01 ；與丁氏潰結(jié)灌腸液低劑量組比較，△△P＜0.01；與美沙拉秦組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

（g/kg）iNOS基因表達(dá)量PPAR-γ蛋白表達(dá)量（IOD/Area）空白組 8 1.463±0.104 0.288±0.023模型組 8 8.714±1.077##0.221±0.015##美沙拉秦組 8 2.4 5.897±0.551##**△△0.260±0.030#**丁氏潰結(jié)灌腸液低劑量組 8 1.5 8.106±0.198##☆☆0.232±0.017##☆丁氏潰結(jié)灌腸液中劑量組 8 3 7.279±0.326##**☆☆0.236±0.013##丁氏潰結(jié)灌腸液高劑量組 8 6 4.992±0.160##**△△0.268±0.013**△△組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病（IBD）。中醫(yī)藥治療UC有明顯優(yōu)勢(shì)。丁澤民教授創(chuàng)新性提出局部從“瘀”論治的辨證思想，創(chuàng)制丁氏潰結(jié)灌腸液，直接作用腸壁，充分發(fā)揮藥物的局部作用[9]，處方以健脾化濕為主，配合清熱化濕、調(diào)和氣血，對(duì)于輕中度UC療效確切[10]。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織PPAR-γ表達(dá)情況（×100）

本研究利用3.5%DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型，對(duì)大鼠進(jìn)行DAI積分、大體評(píng)分、病理評(píng)分，發(fā)現(xiàn)模型組與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明造模成功。MPO的增高被認(rèn)為是量化炎癥的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組MPO含量明顯高于空白組，丁氏潰結(jié)灌腸液和美沙拉秦灌腸液可以顯著降低結(jié)腸炎大鼠MPO活性，高劑量與美沙拉秦效果相當(dāng)，說明丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有一定的治療作用。TNF-α及IL-6在UC腸道黏膜炎癥的擴(kuò)大中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6均較空白組明顯升高，而各藥物治療組上述指標(biāo)明顯低于模型組，提示丁氏潰結(jié)灌腸液、美沙拉秦灌腸液均具有下調(diào)局部炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)的作用，其中對(duì)IL-6的改善作用丁氏潰結(jié)灌腸液與美沙拉秦效果相當(dāng)。iNOS是NO合成的限速酶，檢測(cè)此酶可間接反映NO水平。生理劑量的NO對(duì)消化系統(tǒng)起重要的保護(hù)作用，但是NO產(chǎn)生過多或胃腸道平滑肌對(duì)其敏感性增強(qiáng)可導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織中iNOS的表達(dá)量顯著增加，經(jīng)丁氏潰結(jié)灌腸液中、高劑量干預(yù)后，iNOS表達(dá)量明顯低于模型組，高劑量效果與美沙拉秦相當(dāng)，證明iNOS可能參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展過程，進(jìn)一步解釋丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)選擇美沙拉秦作為陽性藥，它屬于5-氨基水楊酸（5-ASA），通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用。新近研究發(fā)現(xiàn)5-ASA可能通過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR-γ途徑發(fā)揮抗炎和抗瘤作用。PPAR-γ活化后可通過負(fù)性調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)不同的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如NF-κB以及激活蛋白（AP-1）等[11]，從而減少促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子、一氧化氮合酶的產(chǎn)生。前期實(shí)驗(yàn)證明，丁氏潰結(jié)灌腸液可下調(diào)Myd88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB信號(hào)通路[2]。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜中PPAR-γ蛋白表達(dá)量降低，而丁氏潰結(jié)灌腸液高劑量組和美沙拉秦組PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯高于模型組（中、高劑量與美沙拉秦效果相當(dāng)），與結(jié)腸黏膜的損傷程度呈負(fù)相關(guān)。由此我們推測(cè)，丁氏潰結(jié)灌腸液可能起到PPAR-γ激動(dòng)劑的作用。

本實(shí)驗(yàn)初步揭示丁氏潰結(jié)灌腸液可能通過上調(diào)PPAR-γ的水平，減少脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MPO的產(chǎn)生，抑制炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6和炎癥蛋白誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS的表達(dá)，減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)，從而治療潰瘍性結(jié)腸，且其作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。另外，我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，丁氏潰結(jié)灌腸液不僅僅用于疾病活動(dòng)期，在緩解期也適用，可長(zhǎng)期應(yīng)用，因此，下一步我們將對(duì)丁氏潰結(jié)灌腸液的長(zhǎng)期應(yīng)用效果進(jìn)行深入探討。

（致謝：感謝為課題研究付出辛苦努力的課題組和南京市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室、病理科所有工作人員。）