夏儷寧,賈 慧,李 琦,徐 暢,董秀萍,潘錦鋒

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034)

牙鲆魚(Paralichthysolivaceus),別名鲆魚,為硬骨魚綱、鲆科,是比目魚的一類。多寶魚,學(xué)名大菱鲆(Psettamaxima),為硬骨魚綱鰈形目鲆科菱鲆屬海洋底棲魚類。以上兩種魚都屬鲆魚類,因肉質(zhì)白嫩、鮮美可口受到消費(fèi)者的喜愛。2016年我國鲆魚產(chǎn)量為11.8萬噸[1]。

魚肉是一種優(yōu)質(zhì)的食物資源,蛋白含量高、脂肪含量低,且所含脂肪多為不飽和脂肪酸[2-3],營養(yǎng)價(jià)值高。魚肉及魚肉制品呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、色澤、香氣、味道等性質(zhì),主要取決于各種魚肉蛋白的功能性質(zhì)在制備、加工或保藏中的理化性質(zhì)的變化[4-5]。肌肉組織蛋白質(zhì)通?？煞譃槿?肌原纖維蛋白(收縮性蛋白)、肌漿蛋白(代謝性蛋白)、基質(zhì)蛋白(結(jié)締組織蛋白)。肌原纖維蛋白是肌肉中最重要的蛋白質(zhì),又稱為鹽溶性蛋白,約占總蛋白的50%～55%,由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白和調(diào)節(jié)蛋白(原肌球蛋白、肌鈣蛋白)等組成[6]。

肌原纖維是魚肉的基本組成單位,研究表明魚肉的許多加工特性與肌原纖維的特性息息相關(guān)。在魚肉加工保藏過程中,肌原纖維結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)發(fā)生變化,導(dǎo)致魚肉嫩度﹑保水性﹑膠凝性等發(fā)生改變[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牙鲆魚815±5 g、多寶魚887±5 g 購于大連市美林園農(nóng)貿(mào)市場,活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

Ca2+超微量ATP酶測試盒 南京建成生物工程研究所;改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 上海生工生物工程有限公司;金龍魚一級大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司;順丁烯二酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、BBI Life Sciences、氯化鉀等試劑 均為分析純。

Discovery HR-1流變儀 美國TA公司;μDSC微量熱儀 法國SETARAM公司;Infinite200 NANO酶標(biāo)定量測定儀 瑞士TECAN公司;UV-5200型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;AE-6401垂直電泳儀槽 日本ATTO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取分離 鮮活牙鲆魚、多寶魚冰水致死后宰殺去皮去刺,取背部肌肉,將其切成魚塊(2 cm×2 cm×2 cm),置于碎肉機(jī)中,制成肉糜,放于自封袋中,于-30 ℃凍存,6個(gè)月內(nèi)用完。將肉糜加入5倍體積冰冷(4 ℃)的洗液0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate(pH7.0)緩沖液作勻漿處理。高速均質(zhì)3次,每次30 s,間隔20 s置于冰盒中,在10000×g、4 ℃條件下離心10 min,取沉淀,上清液為肌漿蛋白。在沉淀中加入5倍體積的0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate(pH7.0)緩沖液,再次高速均質(zhì)3次,每次30 s,間隔20 s置于冰盒中,10000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,取上清液即為肌原纖維蛋白。采用 Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度[8]。

1.2.2 肌肉蛋白形式測定

1.2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳 樣品制備:將牙鲆魚與多寶魚肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液調(diào)整質(zhì)量濃度為7 mg/mL,采用10%分離膠,5%濃縮膠。以體積比為1∶1混合蛋白液與5×上樣緩沖液,沸水浴5 min。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,以對比牙鲆魚與多寶魚的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白的區(qū)別。

用ATTO 垂直電泳儀,電極緩沖液采用SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng),15 mA/膠恒電流電泳直至溴酚藍(lán)前沿離凝膠下端1 cm左右時(shí)結(jié)束?？捡R斯亮藍(lán)-乙酸-甲醇溶液振蕩染色過夜,去離子水沖洗,再用SDS-PAGE脫色液(50%的乙醇,9%的冰乙酸)脫色,直至條帶清晰。最后用Bio-lmaging Systems MF-ChemBIS 2.0的凝膠成像儀(UV板)成像。

1.2.2.2 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性測定 將1.2.1提取的肌原纖維蛋白濃度調(diào)整至4 mg/mL,采用Ca2+超微量ATP酶測試盒進(jìn)行測定。

我院中心藥房麻精藥品智能化管理系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用…………………………………………………… 沈國榮等（9）：1158

1.2.3 肌原纖維蛋白熱特性

1.2.3.1 差示掃描量熱法(DSC)分析 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,準(zhǔn)確稱取樣品(170±0.1 mg),置于氧化鋁密封坩堝中,密封,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將氧化鋁密封坩堝置于差式掃描量熱儀中。從10 ℃開始,以1 K/min升溫至70 ℃,得到牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白的DSC譜圖。

1.2.3.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué) 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,采用平行板直徑為50 mm 的流變儀進(jìn)行測定,分別將5 mg/mL的牙鲆魚肌原纖維蛋白溶液及5 mg/mL的多寶魚肌原纖維蛋白溶液上樣于兩個(gè)平板之間,調(diào)節(jié)板間的距離為 0.5 mm,除去四周過量的樣品。實(shí)驗(yàn)條件:常應(yīng)變率1 rads-1,擺動(dòng)幅度1%,溫度掃描以2.0 ℃/min的速率從20 ℃開始升溫至80 ℃,隨后降至25 ℃。

1.2.4 肌原纖維蛋白功能特性

1.2.4.1 乳化性的測定 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白濃度至5、10、20 mg/mL,取3 mL蛋白液與10 mL大豆油混合,18000 r/min高速勻漿1 min制成乳狀液,立即于容器底部取樣50 μL,用0.1% SDS 溶液稀釋100倍,劇烈振蕩10 s后在波長500 nm處測定吸光值A(chǔ),以同濃度SDS 溶液作空白[9]。室溫放置10 min后再次取樣測定。每一式樣測定三次取平均值[10]。

其中乳化活性(Emulsifying Activity Index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(Emulsion Stability Index,ESI)計(jì)算公式:

EAI(m2/g)=(2×2.303×dil×A)/(C×φ×10000)

式中:dil-稀釋倍數(shù);A-乳化液吸光值;C-樣品質(zhì)量濃度(g/mL);φ-乳化液中油相比例(0.25)。

ESI(min)=(A0×10)/(A0-A10)

式中:A0-初始乳化液吸光值;A10-10 min后吸光值。

1.2.4.2 起泡性的測定 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白濃度至1、2、5 mg/mL,置于室溫20 min。取15 mL,室溫下16000 r/min高速勻漿1 min。隨后將溶液體系轉(zhuǎn)移至25 mL量筒,計(jì)體積數(shù)A[11]。

其中起泡性(Foaming capacity,FC)和起泡穩(wěn)定性(Foaming stability,FS)計(jì)算公式:

FC(%)=(VT/V0)×100

式中:VT-勻漿后總體積(mL);V0-勻漿前原始體積(mL)。

勻漿后體系室溫下放置5 min后再次量取體積。

FS(%)=(Vt/V0)×100

式中:Vt-勻漿后室溫下靜置5 min后體積(mL);V0-勻漿前原始體積(mL)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件處理分析,數(shù)據(jù)以平均值(average value,AV)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error,SE)形式表示,采用單因素方差法分析數(shù)據(jù),進(jìn)一步以Duncan法進(jìn)行多組平均數(shù)的差異水平分析,顯著性水平設(shè)定為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳

如圖1所示,A、B為7 mg/mL牙鲆魚、多寶魚的肌漿蛋白電泳圖譜。本研究發(fā)現(xiàn)在66.4～44.3 kDa條帶群中多寶魚較牙鲆魚多一條特異條帶。在20.1～44.3 kDa間牙鲆魚肌漿蛋白中較多寶魚肌漿蛋白多兩條較特異條帶。該結(jié)果與蔡揚(yáng)鵬等人對幾種魚肌肉蛋白的研究結(jié)果有明顯差異[12]:鯉魚在15.9 kDa處有一特異條帶,草魚則在41.1和35.9 kDa處有特異條帶。C、D為7 mg/mL牙鲆魚、多寶魚的肌原纖維蛋白電泳圖譜,與蔡揚(yáng)鵬等人研究結(jié)果相似[12],牙鲆魚與多寶魚均在200 kDa處都有一個(gè)明顯的條帶,為肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC),而在44.3 kDa左右也有明顯的條帶,為肌動(dòng)蛋白。66.4 kDa處牙鲆魚較多寶魚多一條特異條帶。牙鲆魚與多寶魚中肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白特異條帶的差別有助于種類的鑒別。

圖1 牙鲆魚、多寶魚肌肉蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of flounder and turbot muscle proteins注：H:High Marker;L:Low Marker;A:多寶魚肌漿蛋白;B:牙鲆魚肌漿蛋白;C:多寶魚肌原纖維蛋白;D:牙鲆魚肌原纖維蛋白。

2.2 肌原纖維蛋白中Ca2+-ATPase活性

肌球蛋白是魚肌肉中最豐富也是最重要的蛋白質(zhì),肌原纖維蛋白的性質(zhì)主要是由肌球蛋白的性質(zhì)決定[13]。肌球蛋白的球狀頭部具有ATPase的活性,則在測定魚肌肉蛋白質(zhì)變性時(shí)通常以肌球蛋白ATPase的活性作為指標(biāo)。如圖2所示牙鲆魚肌原纖維蛋白中Ca2+-ATPase活性要高于多寶魚,與Watabe等報(bào)道的棲息于較高環(huán)境溫度下的魚一般具有更高的肌球蛋白Ca2+-ATPase活性結(jié)論相符合[14]。

圖2 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性Fig.2 Ca2+-ATPase of myofibrillar protein of flounder and turbot

2.3 肌原纖維蛋白DSC分析

差示掃描量熱分析(DSC)是評價(jià)蛋白結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)。肌原纖維蛋白質(zhì)在加熱過程中會(huì)發(fā)生變性和聚集,引起一系列理化特性的變化進(jìn)而造成產(chǎn)品性質(zhì)的變化[15]。熱轉(zhuǎn)化溫度(Tm)反映了蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致其立體結(jié)構(gòu)解離的溫度,其值與被測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)。圖3是牙鲆魚、多寶魚兩種鲆類魚的肌原纖維蛋白的DSC分析圖譜。多寶魚肌原纖維蛋白的Tm值(39.98 ℃)高于牙鲆魚肌原纖維蛋白的Tm值(37.86 ℃)。根據(jù)魯長新研究表明,該溫度出現(xiàn)峰值可能與肌球蛋白有關(guān),二者Tm的差異可能是由于肌球蛋白頭部和尾部熱穩(wěn)定性不同導(dǎo)致的[16]。邵穎等報(bào)道了幾種魚的熱轉(zhuǎn)化溫度Tm,其中武昌魚(44.03 ℃)、鱸魚(44.93 ℃)、草魚(45.67 ℃),均高于多寶魚,而鱖魚(39.33 ℃)與多寶魚相當(dāng)[17]。與邵穎等人研究結(jié)果的差異,可能是由于魚種類及地理環(huán)境的不同所導(dǎo)致的。

圖3 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白DSC曲線Fig.3 DSC heating curve for flounder and turbot myofibrillar protein

2.4 流變特性分析

對牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白在溫度從20～80 ℃的流變性變化進(jìn)行了測定,結(jié)果如圖4所示。所有的樣品中在加熱前其儲(chǔ)藏模量(Storage modulus,G′,或彈性模量)均高于損耗模量(Loss modulus,G″,或粘性模量),表明處理的肌原纖維蛋白體系已經(jīng)具有凝膠樣結(jié)構(gòu)[18-19]。對比牙鲆魚與多寶魚,牙鲆魚與多寶魚的G′在40～50 ℃間有一交叉點(diǎn),隨后隨著溫度的升高,牙鲆魚的儲(chǔ)藏模量G′高于多寶魚,主要是由于蛋白質(zhì)在加熱變性的過程中產(chǎn)生的肌動(dòng)球蛋白之間的交聯(lián),形成的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵限制了蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)造成的[20]。同時(shí)對于損耗模量G″牙鲆魚在40～50 ℃之間有一個(gè)峰,此處為一個(gè)流變特性轉(zhuǎn)折點(diǎn)。多寶魚在50～60 ℃有一個(gè)流變特性轉(zhuǎn)折點(diǎn)。損耗模量G″流變特性轉(zhuǎn)折點(diǎn)與DSC的熱轉(zhuǎn)化溫度點(diǎn)一致。

圖4 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性變化Fig.4 Rheological properties for myofibrillar protein of flounder and turbot

2.5 肌原纖維蛋白特性

2.5.1 乳化性 乳化性是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)之一,主要包括乳化活性指數(shù)(Emulsifying Activity Index,EAI)和乳化穩(wěn)定系數(shù)(Emulsifying Stability Index,ESI)[21-22]。魚肉蛋白質(zhì)的乳化能力以及其乳狀液可由其在500 nm處的吸光度值表示。圖5為牙鲆魚與多寶魚在不同濃度下魚肉肌原纖維蛋白的乳化活性。由圖5可以看出,蛋白乳化活性隨著蛋白濃度的提高而逐漸降低。在低濃度(5 mg/mL)處,牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化活性6.76 m2/g高于多寶魚5.92 m2/g,而在中濃度(10 mg/mL)處,牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化活性3.72 m2/g低于多寶魚4.16 m2/g。本實(shí)驗(yàn)乳化性的結(jié)果是與顧振宇等人的研究結(jié)果有一定的差別[23]。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)選擇原料差異所導(dǎo)致的。由于較大的蛋白聚集體產(chǎn)生,而不能再形成穩(wěn)定的界膜,因此EAI值降低。

圖5 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白乳化活性Fig.5 EAI of flounder and turbot myofibrillar protein

蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性代表蛋白質(zhì)與脂肪小球結(jié)合的能力的變化情況,隨著時(shí)間的增加,被粉碎的小的脂肪球?qū)?huì)開始慢慢聚集形成大的脂肪球,乳化能力降低,使吸光度變小,因此可以通過吸光度的變化來考察蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[24]。圖6為牙鲆魚與多寶魚在不同濃度下魚肉肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性。由圖6可以看出,蛋白乳化穩(wěn)定性隨著濃度的上升變化趨勢是降低的。在低濃度(5 mg/mL)與中濃度(10 mg/mL)處牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性高于多寶魚,而在高濃度(20 mg/mL)處牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性低于多寶魚。勻漿會(huì)使原來分散的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,蛋白變性程度增大,使其乳化穩(wěn)定性降低。

圖6 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性Fig.6 ESI of protein of flounder and turbot myofibrillar protein

2.5.2 起泡性 魚蛋白質(zhì)高分子溶液經(jīng)攪打而產(chǎn)生泡沫的性質(zhì)稱為蛋白質(zhì)高分子的起泡性質(zhì),包括起泡能力(Foaming Capacity,FC)和起泡穩(wěn)定性(Foaming Stability,FS)。由圖7可以看出,肌原纖維蛋白起泡性質(zhì)總體變化趨勢是升高的。如圖7,低濃度(1 mg/mL)時(shí)牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡性低于多寶魚,中濃度(2 mg/mL)與高濃度(5 mg/mL)時(shí)高于多寶魚。同時(shí)隨著濃度的升高,多寶魚起泡性趨于平緩。本實(shí)驗(yàn)起泡性的結(jié)果是與郭浩楠等人的研究結(jié)果相似[25]。

圖7 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白起泡特性Fig.7 FC of flounder and turbot myofibrillar protein

由圖8可以看出,牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡穩(wěn)定性趨于平穩(wěn),而多寶魚肌原纖維蛋白起泡穩(wěn)定性呈現(xiàn)降低的趨勢。隨著蛋白濃度的提高,分子間相互作用形成了穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜遭到破壞,產(chǎn)生的泡沫界面膜易破裂,因而起泡性和泡沫穩(wěn)定性降低[26]。如圖8,低濃度(1 mg/mL)時(shí)多寶魚的肌原纖維蛋白起泡穩(wěn)定性高于牙鲆魚肌原纖維蛋白,高濃度(5 mg/mL)時(shí)牙鲆魚的肌原纖維蛋白起泡穩(wěn)定性高于多寶魚肌原纖維蛋白。中濃度(2 mg/mL)時(shí)二者蛋白起泡穩(wěn)定性相似。

圖8 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白起泡穩(wěn)定性Fig.8 FS of flounder and turbot myofibrillar protein

3 結(jié)論

牙鲆魚與多寶魚水溶性蛋白,牙鲆魚較多寶魚具有特異條帶;而在鹽溶性蛋白中,多寶魚肌球蛋白重鏈多于牙鲆魚。在流變特性中多寶魚肌原纖維蛋白變性溫度高于牙鲆魚,損耗模量G″流變特性轉(zhuǎn)折點(diǎn)與DSC的熱轉(zhuǎn)化溫度點(diǎn)一致。低濃度時(shí)牙鲆魚乳化活性高于多寶魚,中、高濃度時(shí)二者的乳化活性差異不顯著。低濃度牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡性低于多寶魚,中與高濃度時(shí)高于多寶魚。同時(shí)隨著濃度的升高,多寶魚起泡性趨于穩(wěn)定。以上結(jié)果證實(shí),雖皆為鲆鰈類冷水魚,牙鲆魚與多寶魚肌原纖維蛋白的蛋白形式、流變特性、乳化特性以及起泡性等功能特性有一定差異。實(shí)際生產(chǎn)過程中應(yīng)合理設(shè)計(jì)加工條件與工藝,實(shí)現(xiàn)對牙鲆魚和多寶魚魚肉蛋白資源的合理利用與產(chǎn)品開發(fā)。