湯回花,滕 超,2,*,劉丹蕾,鹿發(fā)展

(1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分,約占植物細胞干質(zhì)量的15%～35%[2]。作為一種雜和多聚分子,木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,含有不同類型的糖苷鍵以及多種支鏈取代基,因此要徹底降解木聚糖需要多種酶的協(xié)同參與,其中起主要作用的是β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanohydrolase,EC 3.2.1.8),簡稱木聚糖酶[3],它能隨機地斷開木聚糖主鏈上的糖苷鍵將其徹底水解為木糖、木二糖及木寡糖。在食品、飼料、造紙等方面具有重要的應(yīng)用價值[4],是一種重要的工業(yè)應(yīng)用酶制劑[4-6]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶比較復(fù)雜,尤其是細菌產(chǎn)的木聚糖酶屬于胞內(nèi)酶,粗酶液中一般含多種酶蛋白及其他大分子物質(zhì),為精準考察某單一酶性質(zhì),通常需要對粗酶液進行分離提純。目前用于蛋白質(zhì)分離純化的方法一般有鹽析法、雙水相萃取系統(tǒng)(ATPS)、離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析和親和層析等[8],其中雙水相萃取是一種比較新穎的初級純化方法,國外通過雙水相技術(shù)純化木聚糖酶的研究已受到較多研究者的關(guān)注[9-10],而國內(nèi)此方面研究還相對較少。作為一項較有應(yīng)用前景的初步分離除雜技術(shù),雙水相萃取系統(tǒng)具有設(shè)備要求簡單、可連續(xù)操作、易于放大和條件溫和等特點[11]。本實驗分別采用鹽析法和雙水相萃取法兩種初級純化方法對細菌產(chǎn)胞內(nèi)復(fù)雜代謝產(chǎn)物進行純化效率考察,確定更加適于Paenibacillussp. B1709木聚糖酶初級純化的方法,以期為細菌性木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)木聚糖酶類芽孢桿菌Paenibacillussp. B1709 實驗室自行篩選保藏;櫸木木聚糖(Beechwood xylan) 美國Sigma公司;種子培養(yǎng)液(%):胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl0.50、pH7.4,121 ℃下滅菌20 min 實驗室自配;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)液(%):玉米芯2.00、酵母膏2.00、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50,pH7.0,121 ℃下滅菌20 min實驗室自配。發(fā)酵培養(yǎng)液(%):碳源(80目玉米芯粉)0.8、氮源(牛肉膏)1、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50 實驗室自配;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基己二胺(TEMED)、甘氨酸(Glycine) Biomol公司;聚乙二醇(PEG) 國藥化學(xué)試劑公司;丙烯酰胺、N,N′-甲雙叉丙烯酞胺 Biotopped公司;乙酸、乙酸鈉、過硫酸銨、硫酸銨、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鹽酸等 北京化學(xué)試劑公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SE600型垂直電泳槽 美國GE公司;EPS-601型電泳儀 美國GE公司;LhS-150SC型恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司;pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機 日本 hitachi公司;可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 菌種活化:按比例配制一定量LB固體培養(yǎng)基,高壓滅菌(121 ℃,20 min),平板冷卻后將保藏于甘油管中B1709菌種進行接種,置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

挑取菌種接入種子培養(yǎng)液,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h,將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按一定比例接入基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)液中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,,取其2%的種子培養(yǎng)液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中,37 ℃,180 r/min條件下,搖瓶發(fā)酵72 h。發(fā)酵結(jié)束后,用紗布過濾,濾液8000 r/min離心10 min,收集上清液即為粗酶液。

1.2.2 硫酸銨分級沉淀 硫酸銨分級沉淀方法參照蛋白質(zhì)手冊[12]。準確量取一定體積的粗酶液,在冰水浴中(0～4 ℃)中慢速均勻攪拌,緩慢添加經(jīng)干燥并研磨的硫酸銨粉末至粗酶液中,使酶液中硫酸銨飽和度達20%。結(jié)束后10000 r/min離心10 min,測定上清酶活力和蛋白含量,沉淀用少量緩沖溶液溶解。

準確量取上述離心所得上清液(1 L),重復(fù)以上操作至30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%硫酸銨飽和度,測量各飽和度條件下上清液的木聚糖酶活和蛋白含量。

1.2.3 雙水相體系制備 選擇體系總質(zhì)量為10 g的雙水相體系,按所需比例加入PEG、無機鹽、NaCl等試劑,高純水加熱溶解,系統(tǒng)pH用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整,加入1.5 mL粗酶液,不足部分以水補充。離心(3000 r/min)5 min使其上下相分離,記錄上下相體積,并測定上下相木聚糖酶活性和蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 考察PEG不同分子量對粗酶純化效果的影響 采用 1.2.3方法對粗酶進行純化,萃取條件為:固定萃取條件為PEG濃度20%、磷酸氫二鉀濃度10%、pH7.0,考察PEG不同分子量(1000、2000、4000、6000、8000 Da)對粗酶純化效果的影響。

1.2.4.2 考察PEG濃度(對粗酶純化效果的影響 采用 1.2.3方法對粗酶進行純化,固定萃取條件為PEG分子量為4000、磷酸氫二鉀濃度10%、pH7.0,考察PEG濃度(16%、18%、20%、22%、24%、26%)對粗酶純化效果的影響。

1.2.4.3 考察pH對粗酶純化效果的影響 采用 1.2.3方法對粗酶進行純化,固定萃取條件為PEG分子量為4000、PEG濃度22%、磷酸氫二鉀濃度10%,考察pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對粗酶純化效果的影響。

1.2.4.4 考察無機鹽種類對粗酶純化效果的影響 采用 1.2.3方法對粗酶進行純化,固定萃取條件為PEG分子量為4000、PEG濃度22%、pH6.0,考察無機鹽種類(硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鈉)對粗酶純化效果的影響。

1.2.4.5 考察硫酸銨濃度對粗酶純化效果的影響 采用1.2.3方法對粗酶進行純化,固定萃取條件為PEG分子量為4000、PEG濃度22%、pH6.0、無機鹽為硫酸銨,考察硫酸銨濃度(14%、16%、18%、20%、22%、24%)對粗酶純化效果的影響。

1.2.4.6 考察NaCl濃度對粗酶純化效果的影響 采用 1.2.3方法對粗酶進行純化,固定萃取條件為PEG分子量為4000、PEG濃度22%、pH6、硫酸銨濃度18%,考察NaCl濃度(0、2%、4%、6%、8%、10%)對粗酶純化效果的影響。

進行單因素實驗,考察各因素變量對粗酶純化效果的影響。

1.2.5 木聚糖酶活力的測定 采用DNS法測定木聚糖酶活力[13-14],木聚糖酶活力定義:在55 ℃,pH7.0條件下,每分鐘反應(yīng)生成1 μmol的還原糖(以木糖計)所需要的酶量為一個酶活單位(1U)。比酶活定義為1 mg蛋白所具有的酶活單位(U/mg)。

1.2.6 蛋白含量的測定 采用BCA法[15]進行蛋白含量測定,標準蛋白為牛血清蛋白,測定蛋白樣品在在595 nm下的吸收值,根據(jù)標準曲線計算其中的蛋白含量。

1.2.7 雙水相萃取相關(guān)指標的計算

相比=上相體積/下相體積;

酶分配系數(shù)=上相酶活/下相酶活;

純化倍數(shù)=上相比酶活/原酶液比酶活;

酶活回收率(%)=上相總酶活/原酶液總酶活×100

1.2.8 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶譜分析 利用SDS-PAGE凝膠電泳對純化過的酶液進行純度檢測,其中分離膠濃度為12.5%(w/v),濃縮膠配制濃度為4.5%(w/v),染色液為考馬斯R-250。木聚糖酶酶譜參考Maki[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次,結(jié)果以均值±標準差表示。采用DPS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,顯著性水平(p<0.05)。圖形制作采用Excel軟件數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的標準曲線

由上述實驗方法,在λ=595 nm處測得不同質(zhì)量濃度標準蛋白溶液的吸收值制作的標曲線見圖1,y=0.2637x+0.0013,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,表示線性良好。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

2.2 硫酸銨分級沉淀

通過測定各鹽析條件下上清液的總酶活及蛋白質(zhì)含量,得到變化曲線,見圖2。

圖2 硫酸銨沉淀上清液總木聚糖酶酶活力 及總蛋白質(zhì)含量的變化曲線Fig.2 Effect of ammonium sulphate contenton the total xylanase activity and the protein content of filtrate after precipitation

從圖1可以看出,在鹽析過程中酶活力在硫酸銨飽和度為0%～30%內(nèi)變化不明顯,直到40%時,在蛋白質(zhì)含量繼續(xù)下降的同時,木聚糖酶活力也開始有所下降,說明此階段主要是部分雜蛋白被沉淀下來;當飽和度超過40%后,上清中木聚糖酶活力開始迅速下降,蛋白含量也迅速降低,當硫酸銨飽和度達到80%時,上清液中基本檢測不到酶活力,說明此時木聚糖酶蛋白已經(jīng)幾乎全部被沉淀下來;在此階段,木聚糖酶蛋白得到了較好的濃縮,同時起到了去除部分雜蛋白的作用。

根據(jù)硫酸銨實驗鹽析結(jié)果,最終選取40%作為起始飽和度,80%作為終止飽和度。采用此起始和終止?jié)舛戎苯訉δ揪厶敲复置敢悍旨壋恋?沉淀用pH7.0的緩沖液復(fù)溶后,測定酶活和蛋白質(zhì)含量結(jié)果見表1。

表1 木聚糖酶硫酸銨鹽析結(jié)果Table 1 Result of xylanase ammonium sulfate fractionation

2.3 雙水相萃取木聚糖酶單因素實驗

2.3.1 PEG分子量對粗酶純化效果的影響 由表2可知,5個分子量的聚乙二醇中,PEG 1000體系未成相,無法對粗酶液進行萃取分離,PEG 2000、4000、6000、8000均可以成相,在PEG分子量為4000 Da時,酶的分配系數(shù)、蛋白純化倍數(shù),酶活回收率均為最好。因為PEG分子量通過改變聚合物與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域之間的疏水相互作用影響蛋白質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中的分配,PEG分子量變高會使得PEG與酶分子之間的疏水相互作用增大,使蛋白質(zhì)更好的分配于上相,提高回收率,但是PEG分子量過大會造成聚合物空間位阻增大,蛋白分配系數(shù)和回收率也會隨之下降[17]。

表2 PEG分子量對木聚糖酶萃取效果的影響Table 2 The effect of PEG molecular weight on xylanase extraction

2.3.2 PEG 4000濃度對粗酶純化效果的影響 由表3可知,在這六個濃度梯度下,雙水相體系均可成相,隨PEG4000濃度的增大,分配系數(shù)K值也呈增大趨勢。這是因為對于一定分子量的PEG,當其濃度增加時,雙水相中的親水基團增加,兩相差別增大,有利于目標物的分離。但PEG濃度在雙水相中不宜太高,一方面提高了操作成本,另一方面,PEG4000濃度的增大,上相自由體積減小,導(dǎo)致上相中的蛋白質(zhì)減少[18]。因此在PEG4000濃度為22%時達到最佳萃取效果。

表3 PEG4000濃度對木聚糖酶萃取效果的影響Table 3 The effect of PEG concentrationon xylanase extraction

2.3.3 pH對粗酶純化效果的影響 雙水相體系的pH也是影響分配系數(shù)的關(guān)鍵因素,為探究體系pH對萃取效果的影響,將雙水相體系的pH調(diào)至5.0～9.0范圍內(nèi),結(jié)果如表4所示,在pH為5.0時,體系無法成相,pH為6.0時,萃取效果最佳,之后隨著pH的增大,木聚糖酶回收率開始降低,萃取效果下降,在pH為9.0時,回收率已下降到43.48%。因為pH的變化會造成目標蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的帶電性、離子組成和表面特性的改變,進而影響蛋白在上下相間的分配特性[19]。

表4 pH對木聚糖酶萃取效果的影響Table 4 The effect of pH on xylanase extraction

2.3.4 無機鹽種類對粗酶純化效果的影響 為考察不同無機鹽對萃取效果的影響,選取硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鈉四種無機鹽分別在三個濃度條件下對萃取效果的影響。由表5可知,四種無機鹽對體系成相表現(xiàn)出差異,因為不同的鹽類帶有的正負離子不同,會影響酶在雙水相體系中的分配,并且鹽的種類和濃度還會使得蛋白質(zhì)的表面疏水性改變,造成蛋白質(zhì)兩相間分配平衡的變化[20]。磷酸氫二鈉濃度為10%時,無法與PEG4000成相,其中在三個濃度下,硫酸銨與PEG 4000成相時,酶活回收率和純化倍數(shù)均處于較高水平,其中以硫酸銨作為成相無機鹽時,蛋白純化倍數(shù)相對最大,回收率也很高,在90%左右,因此,選擇硫酸銨作為成相鹽進行后續(xù)實驗。

表5 不同無機鹽木聚糖酶萃取效果的影響Table 5 The effect of inorganic salt on xylanase extraction

2.3.5 最適硫酸銨濃度的確定 由表6可知,木聚糖酶的回收率和純化倍數(shù)在硫酸銨濃度為18%時,純化倍數(shù)為4.5,回收率為94.15%,此濃度下達到最佳萃取效果,之后隨著硫酸銨濃度增加純化倍數(shù)變化較小,但回收率急劇下降,因為過高濃度的鹽會造成蛋白質(zhì)在相界面沉淀,因此最終選取18%作為最適成相鹽濃度。

表6 硫酸銨濃度木聚糖酶萃取效果的影響Table 6 The effect of(NH4)2SO4concentration on xylanase extraction

2.3.6 NaCl濃度對粗酶純化效果的影響 已有研究表明在雙水相體系中加入中性鹽可以加速相分離和改變蛋白質(zhì)的疏水性,可以很好的有助于酶的萃取[21]。結(jié)果如表7所示,在加入氯化鈉的體系中,木聚糖酶回收率和純化倍數(shù)呈現(xiàn)逐漸降低趨勢,與未加入氯化鈉的體系對比可知,在體系中加入2%的氯化鈉可達到最佳萃取效果,此時蛋白純化倍數(shù)顯著提高,達到6.13,是鹽析法的3.44倍。

表7 NaCl濃度對木聚糖酶萃取效果的影響Table 7 The effect of NaCl concentration on xylanase extraction

2.2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶譜分析 將經(jīng)過鹽析純化的粗酶液和雙水相萃取純化的粗酶液進行SDS-PAGE電泳及酶譜分析檢測純度。電泳結(jié)果如圖2顯示,發(fā)酵粗酶液經(jīng)鹽析純化后,顯示有許多雜蛋白,雙水相萃取后純度效果較好,有利于后續(xù)的純化。經(jīng)酶譜分析,菌株B1709粗酶液可以產(chǎn)生多個木聚糖酶,而經(jīng)鹽析及雙水相萃取后,非目標酶蛋白減少甚至完全去除(如圖2所示)。通過對目標蛋白進行分子量粗測,目標蛋白的分子量大約為17 kDa。目前工業(yè)生產(chǎn)的大多為霉菌來源的木聚糖酶,其最適反應(yīng)溫度大多在50～60 ℃左右,最適pH多為中性偏酸,大大制約了木聚糖酶在造紙工業(yè)中高溫高堿環(huán)境下的應(yīng)用[20-22]。因此,Paenibacillussp. B1709進一步豐富了木聚糖酶資源,在工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景,尤其適用于造紙工業(yè)中的生物紙漿及生物漂白[25]。相關(guān)文獻報道[26]低分子量的細菌性木聚糖酶酶解底物時,最初的酶降解產(chǎn)物主要為鏈較長的寡聚糖,適用于低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖3 初級純化電泳圖及酶譜Fig.3 SDS-PAGE and zymogram of primary purification注:1:標準蛋白Maker;2、5(酶譜):發(fā)酵粗酶液;3、6(酶譜):鹽析純化粗酶液;4、7(酶譜):雙水相萃取純化的酶液。

3 結(jié)論

實驗將硫酸銨鹽析和雙水相萃取對Paenibacillussp. B1709木聚糖酶初級純化進行比較,結(jié)果顯示鹽析法可將木聚糖酶的純化倍數(shù)從粗液的1.00提升為1.78,而通過雙水相萃取法可達6.13,是鹽析法的3.44倍?？梢?雙水相萃取法較適于作為層析純化的前導(dǎo)處理手段,可有效減少純化過程中目標蛋白流失,在經(jīng)濟適用的前提下有效規(guī)避鹽析法的弱點。實驗結(jié)果顯示雙水相萃取在大規(guī)模純化尤其針對復(fù)雜純化目標時具備一定技術(shù)的優(yōu)勢,可為類似研究提供一定的實驗參考。