劉文明　范燕云　田釗旭　萬　曼　周　飛　胡益群

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科　廈門大學(xué)消化疾病研究所廈門市消化疾病診治中心(361004)

背景：MicroRNA-9(miR-9)參與調(diào)控生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞自我更新和多向分化等多種生理過程，而且其表達(dá)異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。目的：探討miR-9對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：以real-time PCR檢測(cè)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901中的miR-9表達(dá)。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將miR-9類似物、miR-9抑制物和空載體分別轉(zhuǎn)染BGC-823、SGC-7901細(xì)胞，并以real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果：與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞miR-9表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與空載體對(duì)照組相比，miR-9類似物組BGC-823、SGC-7901細(xì)胞miR-9表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，miR-9抑制物則可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力(P<0.05)。結(jié)論：上調(diào)miR-9表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移，提示miR-9過表達(dá)可能與胃癌進(jìn)展有關(guān)。

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，目前在全世界范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第四位，死亡率居第二位[1]。我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，年新發(fā)病例占全球總數(shù)的40%[2]，在我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中，胃癌均居第三位[3]。由于缺乏特異而有效的早期胃癌篩查指標(biāo)，大多數(shù)胃癌患者就診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，治療效果欠佳，尤其是晚期胃癌患者預(yù)后極差[4]。因此，深入了解胃癌的分子遺傳學(xué)機(jī)制，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因，為胃癌的診斷和治療提供理論依據(jù)成為目前的研究熱點(diǎn)。

微RNA(microRNAs, miRNAs)是一組由基因組編碼的長(zhǎng)度約20～23 nt的非編碼RNA，是廣泛存在于真核生物中的一類重要的調(diào)控分子，通過與靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默作用[5-7]。目前研究認(rèn)為，miRNAs在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能扮演癌基因或抑癌基因的角色[8]，因此對(duì)miRNAs的深入研究對(duì)于探討胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。

MiR-9在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，參與調(diào)控生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞自我更新和多向分化等多種生理過程。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-9表達(dá)異常與血液系統(tǒng)惡性腫瘤、卵巢癌、惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞癌等密切相關(guān)[9-16]。本研究旨在探討miR-9對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為尋找新的胃癌診治靶點(diǎn)提供線索。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、OPTI-MEM減血清培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清(FBS)(GibcoTM, Thermo Fisher Scientific)；miR-9類似物、miR-9抑制物(廣州市銳博生物科技有限公司)；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑、miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR?Green PCR試劑盒(QIAGEN)；TRIzol RNA分離試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)； CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；Transwell小室(BD Biosciences)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：GES-1細(xì)胞培養(yǎng)液為含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基；BGC-823、SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)液為含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基。三株細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天換液，3～4 d進(jìn)行一次傳代。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)miR-9類似物組、miR-9抑制物組和空載體對(duì)照組。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，參照HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染miR-9類似物、miR-9抑制物或空載體。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. Real-time PCR：取未予處理的GES-1、BGC-823、SGC-7901細(xì)胞和轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，以TRIzol RNA分離試劑提取總RNA，以miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以之為模板，采用miScript SYBR?Green PCR試劑盒行PCR擴(kuò)增。MiR-9引物序列：5’-UCU UUG GUU AUC UAG CUG UAU GA-3’；內(nèi)參照U6引物序列：5’-CAA ATT CGT GAA GCG TTC CAT AT-3’。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-9相對(duì)表達(dá)量。

4. CCK-8實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞接種于96孔板(8×103/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，培養(yǎng)1 h后于酶標(biāo) 儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值。應(yīng)用GraphPad Prism軟件，根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)A450繪制生長(zhǎng)曲線。

5. Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，常規(guī)消化、計(jì)數(shù)。以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于Transwell小室上室接種1×105個(gè)細(xì)胞，下室加入500 μL含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出小室，溫PBS清洗，加入-20 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后以濕棉簽去除上室內(nèi)側(cè)面細(xì)胞，PBS清洗，結(jié)晶紫染色。超純水清洗、風(fēng)干后于顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

6. 劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，各組細(xì)胞等量接種于6孔板(以第2 d細(xì)胞長(zhǎng)滿為標(biāo)準(zhǔn))。培養(yǎng)24 h后，使用200 μL無菌槍頭進(jìn)行劃痕，以PBS洗去脫落細(xì)胞，于顯微鏡下拍攝3個(gè)隨機(jī)視野(0 h)，記錄拍攝位置。加入新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基后再次拍照(24 h)，觀察劃痕閉合情況，計(jì)算劃痕閉合率[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、胃癌細(xì)胞miR-9表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

Real-time PCR檢測(cè)顯示，與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1相比，人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901中的miR-9相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

轉(zhuǎn)染miR-9類似物后，BGC-823、SGC-7901細(xì)胞miR-9相對(duì)表達(dá)量較空載體對(duì)照組明顯升高(圖2A)，轉(zhuǎn)染miR-9抑制物后，兩株胃癌細(xì)胞miR-9相對(duì)表達(dá)量較空載體對(duì)照組明顯降低(圖2B)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*兩組間比較，P<0.05

圖1人正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞miR-9表達(dá)比較(real-timePCR)

二、MiR-9促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示48 h和72 h時(shí)各組間A450差異顯著(P<0.05)；與空載體對(duì)照組相比，miR-9類似物組BGC-823、SGC-7901細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，miR-9抑制物組兩株胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)則顯著受抑(圖3)，提示miR-9可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

三、MiR-9提高胃癌細(xì)胞遷移能力

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞接種于小室上室24 h后，miR-9類似物組BGC-823、SGC-7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯多于空載體對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相反，miR-9抑制物組兩株胃癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)均較空載體對(duì)照組減少(P<0.05)(圖4)。上述結(jié)果表明miR-9能提高胃癌細(xì)胞的遷移能力。

選取SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步明確miR-9對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示24 h時(shí)miR-9抑制物組劃痕最寬，空載體對(duì)照組次之，miR-9類似物組劃痕最窄；miR-9類似物組劃痕閉合率明顯高于空載體對(duì)照組和miR-9抑制物組，miR-9抑制物組劃痕閉合率明顯低于空載體對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

*兩組間比較，P<0.05

圖3　各組胃癌細(xì)胞增殖能力比較(CCK-8實(shí)驗(yàn))

*兩組間比較，P<0.05

A：空載體對(duì)照組(左)和miR-9類似物組(右)穿膜SGC-7901細(xì)胞(結(jié)晶紫染色，×200)；B、C：miR-9類似物組和miR-9抑制物組胃癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)

圖4各組胃癌細(xì)胞遷移能力比較(Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn))

表1　各組SGC-7901細(xì)胞遷移能力比較(劃痕實(shí)驗(yàn))

討　　論

MiRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，具有高度保守性、時(shí)序性和組織細(xì)胞特異性，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，主要作為基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控因子，在生物體的多種生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[17]。研究顯示miRNAs異常表達(dá)參與了包括胃癌在內(nèi)的多種常見惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7，18]。

與其他miRNAs一樣，miR-9亦具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)miR-9在多種類型的惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥[9-16]。在人上皮性卵巢癌中，miR-9為獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因素，低表達(dá)患者無病生存期和總生存期明顯縮短[14]；而在肝細(xì)胞癌中，與早期患者相比，晚期患者腫瘤組織中miR-9表達(dá)水平升高，其高表達(dá)與腫瘤臨床分期以及總生存期下降呈正相關(guān)[16]。研究[11]發(fā)現(xiàn)FoxO1、FoxO3是造血細(xì)胞中miR-9的直接作用靶點(diǎn)，上調(diào)FoxO3可抑制miR-9誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞生成。在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株EBV+Raji和EBV-Ramous 中，miR-9可通過BCL-6調(diào)控細(xì)胞凋亡[12]。SIRT1亦為miR-9的靶基因之一，miR-9可通過下調(diào)SIRT1抑制腫瘤細(xì)胞如急性髓性白血病細(xì)胞、惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移[9,15]。在肝細(xì)胞癌中，miR-9通過抑制靶基因上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)參與調(diào)控腫瘤發(fā)生[16]。

為探討miR-9在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究將miR-9類似物和抑制物分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC-7901(同時(shí)設(shè)立空載體對(duì)照組)，通過上調(diào)或下調(diào)miR-9表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示上調(diào)miR-9對(duì)兩種人胃癌細(xì)胞株的惡性增殖行為均具有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)提高細(xì)胞遷移能力，而下調(diào)miR-9則可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，表明miR-9可能參與了胃癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，提示其可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中起癌基因的作用。

綜上所述，上調(diào)miR-9表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移，提示miR-9過表達(dá)可能與胃癌進(jìn)展有關(guān)，有成為胃癌生物學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的潛在可能性。本研究發(fā)現(xiàn)為胃癌惡性進(jìn)展的預(yù)測(cè)及其治療相關(guān)研究提供了新的線索和依據(jù)。