駱杰偉　吳永?！↑S昉萌　陳煒瑋　朱耀彬　魏世超　鄭星宇　楊笑

摘要：目的 通過(guò)高通量16S rDNA測(cè)序，探討不同中醫(yī)證型原發(fā)性失眠患者腸道菌群差異。方法 選擇原發(fā)性失眠患者65例，按中醫(yī)證型分為肝郁化火組22例、心脾兩虛組17例、陰虛火旺組26例，健康體檢者47例為對(duì)照組。采用高通量16S rDNA測(cè)序方法分析患者便菌群結(jié)構(gòu)，QIIME軟件與R語(yǔ)言stats包等分析菌群差異。結(jié)果 共得到1226個(gè)不同的基因序列分類(lèi)單元（OTUs），4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的OTUs共180個(gè)（P<0.05），表明樣品有豐富的菌落。肝郁化火組、陰虛火旺組測(cè)序序列的定位個(gè)數(shù)多于心脾兩虛組及對(duì)照組（P<0.05）。非加權(quán)UniFrac分析顯示，組間差異顯著大于組內(nèi)差異，表明分組有意義（R=0.103，P=0.002），提示腸道菌群多樣性與失眠不同證型高度相關(guān)。屬水平在不同組間明顯差異共57個(gè)屬（P<0.05），所有物種水平不同組間明顯差異共115個(gè)物種（P<0.05）。對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬包括：普雷沃氏菌屬（prevotella）、巨單胞菌屬（megamonas）、梭菌屬（clostridium Ⅺ、clostridiuum ⅩⅧ）、魏斯氏菌屬（weissella）、擬普雷沃氏菌屬（alloprevotella）；肝郁化火組優(yōu)勢(shì)菌屬包括：考拉桿菌屬（phascolarctobacterium）、黃桿菌屬（flavonifractor）、埃格特菌屬（eggerthella）、嗜膽菌屬（bilophila）；心脾兩虛組優(yōu)勢(shì)菌屬包括：鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、甲基桿菌屬（methylobacterium）；陰虛火旺組優(yōu)勢(shì)菌屬包括：擬桿菌屬（bacteroides）、副擬桿菌屬（parabacteroides）、parasutterella、butyricimonas、odoribacter。結(jié)論 原發(fā)性失眠患者具有豐富的腸道菌群多樣性及不同菌群結(jié)構(gòu)，可能影響著不同中醫(yī)證候的發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性失眠；中醫(yī)證候；16S rDNA測(cè)序；腸道菌群

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.007

中圖分類(lèi)號(hào)：R256.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0028-07

Abstract： Objective To explore structural differences of intestinal flora in primary insomnia patients with different TCM syndromes through the high-throughput 16S rDNA sequencing analysis. Methods Totally 65 patients with primary insomnia were divided into 22 patients with syndrome of liver depression transforming into fire， 17 patients with deficiency of both heart and spleen syndrome， 26 patients with syndrome of hyperactivity of fire due to yin deficiency， with 47 cases of healthy people as the control group. The fecal flora structure of the subjects was analyzed by high-throughput 16S rDNA sequencing. QIIME software and R language stats package were used to analyze the diversity of flora. Results Totally 1226 different operational taxonomic units （OUTs） were obtained， and there were 180 significant differences among the 4 groups （P<0.05）， indicating that the samples were rich in microbial colonies. The mapped reads in group of liver depression transforming into fire and hyperactivity of fire due to yin deficiency were more than the group of deficiency of both heart and spleen and the control group （P<0.05）. Unweighted UniFrac analysis showed that the difference among groups was remarkably greater than the difference within group， and the grouping was statistically significant （R=0.103， P=0.002）. It suggested that the diversity of intestinal flora was highly correlated with different TCM syndromes of insomnia. There were a total of 57 genera found significant differences among the different groups at the genus level （P<0.05）， and 115 species at all species level. The dominant flora of the control group were prevotella， megamonas， clostridium Ⅺ （clostridium ⅩⅧ）， weissella， and alloprevotella； The dominant flora of liver depression transforming into fire syndrome were phascolarctobacterium， flavonifractor， eggerthella， and bilophila； The dominant flora of deficiency of both heart and spleen syndrome were sphingomonas and methylobacterium； The dominant flora in hyperactivity of fire due to yin deficiency syndrome group were bacteroides， parabacteroides， parasutterella， butyricimonas， odoribacter. Conclusion The patients with primary insomnia have abundant intestinal flora diversity and diverse flora structure， which may affect the occurrence， development and outcome of different TCM syndromes.

Keywords： primary insomnia； TCM syndromes； 16S rDNA sequencing； intestinal flora

人體微生物組是指在人體內(nèi)或表面存在的生態(tài)群落中共生、共棲和致病的微生物的總稱(chēng)，由Lederberg J等[1]最先提出。廣義人類(lèi)基因的范疇包括人類(lèi)基因組和微生物組組合，人的新陳代謝功能具有人與微生物的特性。人體的共生微生物群被認(rèn)為是“人體第二基因組”。在許多案例中微生物被推定為變異原因，可以影響宿主表型[2]。只有人體基因組與微生物組和諧統(tǒng)一，才能實(shí)現(xiàn)人體陰平陽(yáng)秘。失眠是人群中最常見(jiàn)的精神障礙之一，本研究通過(guò)腸道菌群細(xì)菌16S rDNA的V3、V4區(qū)域的高通量測(cè)序[3-4]，探討不同證型失眠的菌群多樣性特征，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月-2017年1月福建省立醫(yī)院原發(fā)性失眠患者65例。平均年齡（49.04±11.70）歲；中位病程6（2.5～15）年；男性31例，女性34例；肝郁化火證22例（男女各11例）、心脾兩虛證17例（男8例，女9例）、陰虛火旺證26例（男12例，女14例）。收集同期福建省立醫(yī)院體檢中心健康體檢者47例為對(duì)照組，平均年齡（48.62±12.98）歲；男性24例，女性23例。失眠患者與對(duì)照組的年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)福建省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（K2015-012-01）。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中國(guó)失眠防治指南》[5]制定原發(fā)性失眠癥相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。在睡眠機(jī)會(huì)和環(huán)境均良好、充分的條件下，發(fā)生以失眠癥狀為主的睡眠質(zhì)量不滿(mǎn)意狀況，包括難以入眠、睡眠不深、多夢(mèng)、醒后不易再睡，早醒，或自覺(jué)睡眠明顯不足等。

1.3 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[6]制定中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)。由固定的3位中醫(yī)副主任醫(yī)師辨證一致，予以確認(rèn)。①肝郁化火證：急躁易怒，不寐多夢(mèng)，甚至徹夜不眠，伴有頭暈頭脹，目赤耳鳴，口干而苦，不思飲食，便秘溲赤。舌紅苔黃，脈弦而數(shù)。②心脾兩虛證：多夢(mèng)易醒，心悸健忘，神疲食少，頭暈?zāi)垦?，伴有四肢倦怠，面色少華。舌淡苔薄，脈細(xì)無(wú)力。③陰虛火旺證：心悸不安，心煩不寐，腰酸足軟，伴頭暈，耳鳴，健忘，遺精，口干津少，五心煩熱。舌紅少苔，脈細(xì)而數(shù)。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述西醫(yī)診斷及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)者；②受試者對(duì)本研究知情，并簽屬知情同意書(shū)。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

①軀體疾病或大腦精神、意識(shí)功能障礙等所致的繼發(fā)性失眠；②患有糖尿病、血液病、心力衰竭、腎衰、感染性疾病等基礎(chǔ)疾??；③患有肝炎、結(jié)核病等傳染性疾??；④有吸煙和飲酒嗜好者；⑤不能進(jìn)行正常交流及合作者；⑥有放化療史者。

1.6 方法

1.6.1 糞便樣品采集、DNA提取

檢查前1 d禁酒及藥物，檢查前8 h禁食。晨起7時(shí)取糞便樣本，樣本取備按照流程HMP手冊(cè)（Version 12.0，Accession：phd003190.2）。分裝后立即置于-80 ℃冰箱。DNA提取嚴(yán)格按MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用16s rRNA通用引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Thermo Nano Drop 2000及瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)控PCR產(chǎn)物，27F、1492R引物由Lifetech/Thermo合成。

1.6.2 16s rDNA基因V3、V4區(qū)測(cè)序

PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化后，經(jīng)文庫(kù)質(zhì)檢合格，使用Qubit進(jìn)行文庫(kù)定量，根據(jù)每個(gè)樣品數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合均一化。用16S特定引物擴(kuò)增特異可變區(qū)V3、V4區(qū)域，得425 bp擴(kuò)增片段。加接頭（adeptor linkage），采用MiSeq PE300測(cè)序，應(yīng)用PANDAseq軟件拼接配對(duì)雙端的reads[7]。經(jīng)過(guò)拼接處理后，得到較長(zhǎng)堿基序列（clean reads），進(jìn)行16S分析。細(xì)菌16S rDNA的測(cè)序引物，U341：CCTACGG GRSGCAGCAG，U806：GGACTACVVGGGTATCT AATC[3-4]。由上海銳翌生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6.3 基因序列分類(lèi)單元聚類(lèi)

將序列完全一樣的clean reads歸為1種tag，統(tǒng)計(jì)每條tag對(duì)應(yīng)的豐度（即reads數(shù)目），根據(jù)tags豐度大小進(jìn)行排序。因?yàn)閟ingletons（對(duì)應(yīng)reads只有1條的序列）可能由于測(cè)序錯(cuò)誤造成，故去除該部分序列，不進(jìn)行后期基因序列分類(lèi)單元（OTUs）聚類(lèi)。利用usearch在0.97相似度下進(jìn)行聚類(lèi)，對(duì)聚類(lèi)后的序列進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，得到用于物種分類(lèi)的OUT，將所有clean reads比對(duì)到OTUs序列上，比對(duì)上OTUs的reads提取出來(lái)得到最終的mapped reads[8]。利用Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)該代表序列與已知物種的16S DNA，對(duì)每個(gè)OTUs進(jìn)行物種歸類(lèi)[9]。

1.6.4 樣品復(fù)雜度分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用QIIME軟件分析Alpha多樣性與Beta多樣性[10]，采用迭代算法，分別在加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息和不加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息的情況下進(jìn)行差異計(jì)算，做出組間的距離box圖。2組間差異分析采用R語(yǔ)言stats包的wilcox.test函數(shù)，多組間差異分析采用R語(yǔ)言kruskal.test函數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映單個(gè)樣品的物種多樣性，包括observed species指數(shù)、chao1指數(shù)、PD whole tree指數(shù)等[10]。observed species和chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度（species richness），如樣品中物種多樣性較高，顯示較多未被測(cè)序檢測(cè)到的物種。Shannon指數(shù)、simpson指數(shù)反映的是群落的多樣性（species diversity）。PD whole tree指數(shù)反映了樣品中物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異，PD whole tree指數(shù)越大說(shuō)明物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異越大。4組間諸種指數(shù)差異不明顯（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 基因序列分類(lèi)單元分析

OTUs的豐度初步說(shuō)明了樣品的物種豐富程度。kruskal.test檢驗(yàn)提示肝郁化火組、陰虛火旺組樣本的mapped reads較心脾兩虛組、對(duì)照組多（P<0.05），說(shuō)明前2組具有更多的物種多樣性，見(jiàn)表2。本研究共得到1226個(gè)不同的OTUs，4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的OTUs有180個(gè)（P<0.05）。

2.3 樣本復(fù)雜性與顯著性差異分析

物種profiling柱狀圖可直觀顯示各樣本的物種及其豐度，初步顯示各組物種差異。在屬水平，各樣本豐度高的前20物種profiling柱狀圖，見(jiàn)圖1。選擇豐度前30的差異物種，通過(guò)R軟件corrplot包繪制優(yōu)勢(shì)物種間spearman相關(guān)性熱圖，通過(guò)該熱圖發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)物種之間重要的模式與關(guān)系。種間關(guān)系會(huì)影響物種豐度，從屬水平反映各菌屬的共生、拮抗關(guān)系的強(qiáng)弱，見(jiàn)圖2。相似性分析（Anosim分析）檢驗(yàn)，即非加權(quán)UniFrac，顯示組間差異顯著大于組內(nèi)差異，分組有意義（非加權(quán)R=0.103，P=0.002）?？梢?jiàn)，腸道微生物的不同多樣性與失眠不同中醫(yī)證型呈現(xiàn)高度相關(guān)。

LDA EffectSize（LEfSe）Tools采用線(xiàn)性判別分析（LDA）估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，找出對(duì)樣品歸類(lèi)產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種[11]。本研究4組間有差異物種見(jiàn)表3。通過(guò)Kruskal-Wallis test分析，屬水平找出在不同組間有明顯差異共57個(gè)屬（P<0.05），其中部分屬種熱圖（heatmap）、箱線(xiàn)圖（boxplot）見(jiàn)圖3、圖4。所有物種水平可以找出在不同組間有明顯差異共115個(gè)物種（P<0.05），其中部分屬種熱圖、箱線(xiàn)圖見(jiàn)圖5、圖6。分析可見(jiàn)，對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬有普雷沃氏菌屬（prevotella）、巨單胞菌屬（megamonas）、梭菌屬（clostridiumⅪ、clostridiuumⅩⅧ）、魏斯氏菌屬（weissella）、擬普雷沃氏菌屬（alloprevotella）等菌屬；肝郁化火組優(yōu)勢(shì)菌屬有考拉桿菌屬（phascolarctobacterium）、黃桿菌屬（flavonifractor）、埃格特菌屬（eggerthella）、嗜膽菌屬（biophila）等菌屬；心脾兩虛組優(yōu)勢(shì)菌屬有鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、甲基桿菌屬（methylobacterium）等菌屬；陰虛火旺組優(yōu)勢(shì)菌屬有擬桿菌屬（bacteroides）、副擬桿菌屬（parabacteroides）、parasutterella、butyricimonas、odoribacter等。

3 討論

《素問(wèn)·逆調(diào)論篇》言：“胃不和則臥不安?！敝嗅t(yī)學(xué)早已認(rèn)識(shí)到胃腸道功能與睡眠障礙密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，腸道菌群與精神神經(jīng)疾病的相關(guān)性得到廣泛關(guān)注。如孤獨(dú)癥、帕金森病、精神分裂癥、抑郁癥、阿爾茨海默病、神經(jīng)退行性疾病等常伴有腸道菌群失調(diào)，二者互相影響。若患者長(zhǎng)期失眠，處于焦慮、抑郁等應(yīng)激狀態(tài)下，則影響腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，考拉桿菌屬、嗜膽菌屬等為失眠肝郁化火證優(yōu)勢(shì)菌屬，而考拉桿菌屬為定植在腸道內(nèi)條件致病菌。有研究表明，其豐度與抑郁癥、腸易激綜合征及陽(yáng)虛質(zhì)有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者顫桿菌屬、嗜膽菌屬的豐度明顯升高，普雷沃氏菌屬、糞球菌屬（coprococcus）豐度下降[14]；普雷沃氏菌屬在本研究為對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌群，可見(jiàn)在失眠肝郁化火證中為劣勢(shì)。有報(bào)道，腦卒中后抑郁癥患者腸道菌群結(jié)構(gòu)異常，以考拉桿菌屬、顫桿菌屬（oscillibacter）、parasutterella為優(yōu)勢(shì)菌屬[15]。本研究顯示，parasutterella、擬桿菌屬、副擬桿菌屬等為失眠陰虛火旺證優(yōu)勢(shì)菌屬。褪黑色素是睡眠與覺(jué)醒調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)之一，用褪黑素復(fù)合制劑后，腸道內(nèi)擬桿菌屬較前明顯下降[16]，可見(jiàn)失眠與菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)明顯相關(guān)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明，疾病、精神行為與腸道菌群也有密切關(guān)系。在相對(duì)缺乏腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的小鼠中，迷走神經(jīng)發(fā)育發(fā)生變化可能影響腸道菌群[17]，口服抗生素后腸道菌群擬桿菌屬含量升高，而副擬桿菌屬、顫螺菌屬（oscillospira）、考拉桿菌屬含量下降，影響大腦BDNF表達(dá)?；謴?fù)腸道菌群后，可恢復(fù)腦功能[18]。而擬桿菌屬、副擬桿菌屬等為本研究中失眠陰虛火旺證優(yōu)勢(shì)菌屬，考拉桿菌屬為失眠肝郁化火證優(yōu)勢(shì)菌屬，這些菌群失衡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失衡影響精神行為，又如當(dāng)無(wú)菌小鼠（GF）BALB/c、NIHSwiss接種同種小鼠的腸道菌群后，其行為與同種小鼠的行為類(lèi)似，但接種不同種小鼠的腸道菌群后，其行為則受腸道菌群供體源小鼠的影響，表現(xiàn)出與供體小鼠相類(lèi)似的行為[19]。從而說(shuō)明腸道菌群可直接調(diào)控大腦功能，影響生物行為。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，孕期母體高脂肪飲食導(dǎo)致子代腸道內(nèi)乳酸桿菌缺乏，出現(xiàn)社交缺陷及腦獎(jiǎng)賞環(huán)路突觸強(qiáng)化功能缺陷，通過(guò)后期定植乳酸桿菌可改善[20]。腸道梭形桿菌數(shù)量減少會(huì)引起小鼠應(yīng)激能力減弱[21]。也有發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌感染小鼠后，迷走神經(jīng)張力增加，大腦中神經(jīng)元激活標(biāo)志物c-Fos表達(dá)增加，導(dǎo)致感染小鼠出現(xiàn)焦慮行為[22]。

人體共棲的腸道菌群引起疾病的機(jī)制尚不清楚。目前研究認(rèn)為，微生物可能通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）或直接影響腸道上皮的通透性，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗等[23-24]，腸道微生物也可通過(guò)復(fù)雜的腸-腦軸機(jī)制影響人的情緒、行為等。失衡的菌群可能引起或加重大腦組織中的腦神經(jīng)元損傷，影響宿主行為和大腦功能。通過(guò)人為改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原有的腸道菌群結(jié)構(gòu)，其焦慮抑郁狀態(tài)、認(rèn)知行為及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與正常動(dòng)物有明顯區(qū)別[25-26]。BDNF廣泛分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、分化及存活有較大影響。在GF海馬等區(qū)域的BDNF蛋白、mRNA表達(dá)明顯降低，常伴有HPA軸發(fā)育異常，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)、認(rèn)知發(fā)生改變[25，27-29]。GF的5-羥色胺（5-HT）和谷氨酸受體的表達(dá)也出現(xiàn)異常[30]。5-HT影響情緒、自主功能、神經(jīng)肌肉及內(nèi)臟功能，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物也影響體內(nèi)5-HT產(chǎn)生。5-HT表達(dá)主要與產(chǎn)芽孢細(xì)菌密切相關(guān)[31]。顫桿菌屬是定植于腸道內(nèi)的厭氧條件致病菌，與抑郁癥、心腦血管疾病以及腸道菌群代謝產(chǎn)物血漿氧化三甲胺（TMAO）的合成與代謝相關(guān)[13，32]。目前大多認(rèn)為，血漿TMAO升高是心血管危險(xiǎn)因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，長(zhǎng)期定植于宿主體內(nèi)的共生菌群免疫系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)識(shí)別侵入腸道內(nèi)病原菌，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，是通過(guò)腸上皮細(xì)胞啟動(dòng)及傳導(dǎo)的信號(hào)如Toll樣受體來(lái)實(shí)現(xiàn)[33-34]。此外，相關(guān)細(xì)菌也可以促進(jìn)免疫功能，如腸道微生物中的分節(jié)絲狀菌、擬桿菌、梭形菌等促進(jìn)了T細(xì)胞分化，產(chǎn)生腸道強(qiáng)大的先天性、適應(yīng)性免疫應(yīng)答[35]。腸道內(nèi)共有多種與腸內(nèi)分泌相關(guān)的細(xì)胞，通過(guò)HPA軸聯(lián)系中樞，應(yīng)激時(shí)皮質(zhì)醇釋放，作用于腸道，影響免疫、腸道黏膜滲透性及腸道屏障功能，改變菌群構(gòu)成。反之，失調(diào)的腸道菌群也可通過(guò)HPA軸調(diào)控大腦功能，支配腸道內(nèi)外的神經(jīng)共同形成多條反射回路來(lái)調(diào)控腸道活動(dòng)與應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，腸道菌群的改變可能是引起精神性疾病如失眠的危險(xiǎn)因子，或失眠導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，二者互相影響則表現(xiàn)出不同中醫(yī)證候特征，如大便性狀的改變。

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（收稿日期：2017-09-14）

（修回日期：2017-10-22；編輯：季巍?。?/p>