楊仕美 喬光 文曉鵬

摘 要：基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序序列設(shè)計引物，以生物學(xué)性狀差異明顯的11份火龍果種質(zhì)DNA為材料，采用正交試驗設(shè)計，對影響火龍果EST- SSR-PCR擴增的2×Taq PCR MasterMix、引物及模板DNA濃度等因素進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上對變性聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度及上樣量進(jìn)行篩選確定。以期建立適合火龍果的EST-SSR-PCR最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，優(yōu)化后的火龍果EST- SSR-PCR擴增的最佳反應(yīng)體系為：10 μL混合反應(yīng)體系含基因組DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR引物。在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測中，10%的變性聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度、2.5μL上樣量擴增效果最佳。該體系的建立可為今后利用EST-SSR標(biāo)記對火龍果遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：火龍果；SSR標(biāo)記；體系優(yōu)化

中圖分類號：S667.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0014-07 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.003

Establishment and Optimization of EST-SSR Marker Methodology in Pitaya

YANG Shimei1，2，QIAO Guang2，WEN Xiaopeng2*

（1.College of Life Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. Institute of Agro-bioengineering/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China ）

Abstract：Based on the RNA-Seq of Hylocereus polyrhizuse， EST-SSR markers were investigated. SSR primers were designed and synthesized. Genomic DNA of pitaya germplasms from 11 obviously distinguishable phenotypes were used to carry out PCR. To optimize the experimental system， the effect degree of 2×Taq PCR MasterMix， primers and DNA template concentration was analyzed respectively through orthogonal test. Furthermore， the suitable loading quantity and concentration for de-naturing polyacrylamide gel electrophoresis were determined. The results showed that the optimal amplification system was 10 μL mixture containing 30 ng DNA template， 6μL 2×PCR Mix， and 0.6 μL （10-5 mol/L） EST-SSR primer. The optimal concentration for de-naturing polyacrylamide gel electrophoresis was 10%， and the loading quantity was 2.5 μL. Our results indicated that the optimized SSR-PCR system on pitaya germplasms would provide theoretic and technical support for analysis of genetic diversity， establishment of genetic maps， gene localizations and molecular marker assisted breeding.

Key words：pitaya； EST-SSR marker； system optimization

火龍果（Hylocereus spp.）屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）和蛇鞭柱屬（Seleniereus），是近年來被廣泛關(guān)注的一種新興熱帶、亞熱帶水果[1]。貴州省“十三五規(guī)劃”中，將火龍果列為第一支持產(chǎn)業(yè)。近年來，貴州省開展了火龍果新種質(zhì)挖掘工作，發(fā)現(xiàn)大量具有優(yōu)異性狀的種質(zhì)資源，為進(jìn)一步開展遺傳育種研究工作奠定了材料基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RAPD、AFLP、ISSR、SLAF-seq和MSAP[2-6]等分子標(biāo)記技術(shù)已被用于火龍果種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析及遺傳穩(wěn)定性檢測，但這些多為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體和雜合體，且這些分子標(biāo)記覆蓋火龍果基因組比例較小，標(biāo)記密度較低[7]。

簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat， SSR）是一類由1～6個堿基組成的基元串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[8]，由于SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源評價、遺傳多態(tài)性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究[9]。根據(jù)建立SSR標(biāo)記的序列性質(zhì)不同，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR（gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）[10]。傳統(tǒng)的基因組SSR標(biāo)記開發(fā)費時、費力且成本高，而利用EST數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR標(biāo)記比較簡單有效，并且EST本身是基因的一部分，可直接反應(yīng)基因的表達(dá)信息，比gSSR具有更高的保守性和通用性[11]。但火龍果EST-SSR標(biāo)記的研究尚未見報道。

EST-SSR是基于PCR技術(shù)的一種分子標(biāo)記技術(shù)[12-13]，為確定PCR結(jié)果的可靠性，建立和優(yōu)化出最佳PCR反應(yīng)體系是必要的[14]。而在EST-SSR引物開發(fā)過程中，DNA電泳步驟對結(jié)果的分析處理有著直接的影響，其條帶的外觀、清晰度均直接影響實驗結(jié)果[15]。本研究基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序序列設(shè)計引物，選取11份生物學(xué)性狀差異明顯的火龍果種質(zhì)DNA為材料，采用正交試驗設(shè)計，對影響火龍果 EST-SSR-PCR 擴增的2×Taq PCR MasterMix、引物及模板DNA 濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上對變性聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度及上樣量進(jìn)行篩選確定，建立火龍果EST-SSR-PCR擴增的最佳反應(yīng)體系，為今后利用EST- SSR 標(biāo)記對火龍果遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用火龍果種質(zhì)材料均取自貴州省果樹科學(xué)研究所種質(zhì)資源圃，共11份（表1），取幼嫩莖尖，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

采用DNAsecure Plant Kit（DP320，北京天根生化科技有限公司）試劑盒提取基因組

DNA，利用微量分光光度計（北京奧凱/K5500）和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和濃度，并用TE緩沖液將其稀釋至約20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆??；谇捌诠ぷ髦兴@得的火龍果轉(zhuǎn)錄組測序序列進(jìn)行引物設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物具體信息見表2。

1.3 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

用2×Taq PCR Mix，將dNTPs、Taq酶和Mg2+3個因素作為整體，綜合評價其對火龍果SSR-PCR反應(yīng)體系的影響。采用L16（43）正交試驗設(shè)計對SSR-PCR反應(yīng)體系的主要影響因素2×Taq PCR Mix 用量、引物濃度和模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化（選用火龍果種質(zhì)R1的DNA作為模板），共16個處理（表3），重復(fù)三次，反應(yīng)的總體積為10 μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸8 min，4℃ 保存。

1.4 退火溫度的篩選

PCR擴增反應(yīng)中，退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，每對引物最適宜的退火溫度不同。以引物的參考退火溫度±4℃上下浮動，分別手動設(shè)置5個溫度梯度值（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），對火龍果種質(zhì)R1的DNA模板進(jìn)行PCR擴增，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)檢測結(jié)果確定引物最佳退火溫度。

1.5 變性膠技術(shù)體系的確定

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為6%、8%和10%三個梯度，具體組成成分及添加順序如表4。利用引物C13748對11份火龍果種質(zhì)DNA進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在不同質(zhì)量濃度的聚丙烯酰胺變性凝膠下電泳2.5 h，根據(jù)擴增情況，確定最適變性聚丙烯凝膠濃度。

1.6 聚丙烯變性凝膠電泳上樣量的優(yōu)化

根據(jù)已經(jīng)確定的EST-SSR-PCR最佳反應(yīng)體系，采用引物C13748對火龍果種質(zhì)R1和R2的DNA進(jìn)行PCR擴增，共設(shè)計5個上樣量梯度，分別為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0μL，選擇最佳上樣量[16]。

1.7 PCR產(chǎn)物檢測

瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物檢測選用1×TAE（Tris-Aceticacid-EDTA， PH8.0）電泳緩沖液，在含有GoldViewⅠ的2%瓊脂糖凝膠中，以5 V/cm的電壓電泳一段時間，置于凝膠成像儀（英國Syngene/G：BOX）中觀察并拍照保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：上樣前先在10μL PCR擴增產(chǎn)物中加5μL loading buffer ，混勻，置PCR儀（ABI/Verite）上97℃變性10 min，點樣量為2.5μL。然后打開電源，調(diào)試工作環(huán)境為電壓150 V，電泳2.5 h。電泳結(jié)束后，小心取下凝膠，置于托盤中，用ddH2O漂洗2次，進(jìn)行銀染檢測。

首先配置500 mL 10%的冰乙酸（50 mL的冰乙酸中加ddH2O定容至500 mL）倒入裝有凝膠的托盤中，室溫下置于旋轉(zhuǎn)搖床上均勻晃動20 min進(jìn)行固定。固定后的凝膠用ddH2O漂洗2次，倒入染色液（500 mL的ddH2O中加入0.5AgNO3和3 ml 37%的甲醛），置于旋轉(zhuǎn)搖床上均勻晃動15 min進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，用ddH2O漂洗2次，加入顯色液（500 mL 1.5%的NaOH加2 mL 37%的甲醛）置于搖床上晃動，直到譜帶清晰時停止。倒掉顯色液，用ddH2O漂洗2次。立即用數(shù)碼相機拍照記錄[17]。

1.8 擴增體系穩(wěn)定性驗證

利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)程序，選擇EST-SSR多態(tài)性引物C30929和C30192對11份火龍果種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性擴增，并采用10%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測體系反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果基因組DNA的提取

提取的火龍果基因組DNA經(jīng)微量分光光度計（北京奧凱/K5500）測得其OD260/OD280值的范圍是1.6～2.0，平均值1.85，OD260/OD230值范圍為1.8～2.4，平均值2.08。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。DNA電泳帶集中于點樣孔附近，條帶清晰明亮，表明提取的DNA質(zhì)量較好，可作為PCR擴增模板。

2.2 PCR體系的優(yōu)化

以L16（43）正交試驗設(shè)計，利用引物C13748對火龍果種質(zhì)R1的DNA進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2，根據(jù)是否擴增出目的條帶，以及條帶的亮度和清晰度為判斷依據(jù)，對各組合的擴增結(jié)果進(jìn)行分析。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖中的第1、2、3、4、7和8泳道的擴增條帶極為模糊，第5、6、9、10、11、15和16泳道有明顯的擴增條帶，但條帶亮度一般。第12、13和14泳道的擴增條帶最為亮度最好，其中亮度最好，條帶最為清晰銳利的為泳道14，由此篩選出最優(yōu)EST-SSR-PCR擴增反應(yīng)體系組合為14，即：10μL體系中包含1.5μL的DNA模板，10 -5mol/L的引物0.6μL（正、反向引物各0.30μL），6μL 2×Taq PCR MasterMix及適量ddH2O。

2.3 引物退火溫度篩選

PCR反應(yīng)中，退火溫度可能直接影響模板與引物的特異性結(jié)合。試驗設(shè)置5個退火溫度（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），對火龍果種質(zhì)R1的DNA進(jìn)行PCR擴增（圖3）。結(jié)果表明，引物C30929在退火溫度為62℃時，無擴增條帶。退火溫度低于58℃時，出現(xiàn)擴增條帶彌散、背景增強的現(xiàn)象。而退火溫度為58℃時，所得擴增條帶最為清晰明亮，背景最淺，由此確定引物C30929的最佳退火溫度為58℃。引物C13748的擴增中，當(dāng)退火溫度為58℃時，所得擴增條帶最為清晰明亮，當(dāng)退火溫度為62℃時，出現(xiàn)非特異性擴增條帶，且主帶亮度較弱。所以確定C13748的最佳退火溫度為58℃。引物C30192的退火溫度確定方法如上，其最佳退火溫度為61℃。

2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)體系

利用引物C13748對11份火龍果種質(zhì)DNA進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在不同質(zhì)量濃度的聚丙烯酰胺變性凝膠下電泳2.5 h，電泳結(jié)果顯示（圖4），當(dāng)變性PAGE膠的濃度為6%時（圖4A），電泳條帶聚集在一起，不能很好的分散開來，無法區(qū)分條帶數(shù)目。當(dāng)變性PAGE膠的濃度為8%（圖4B）時，由于隨著膠濃度的增加，分辨能力有所加強，條帶趨于分散，但還是不夠清晰，對條帶的準(zhǔn)確判讀有一定的影響。當(dāng)膠的濃度繼續(xù)增加到10%（圖4C）時，擴增條帶完全分散開來，可以準(zhǔn)確的進(jìn)行條帶統(tǒng)計，但染色背景不夠清晰，需改善染色操作過程。綜合評價，火龍果EST-SSR聚丙烯酰胺變性凝膠電泳最適質(zhì)量濃度為10%。

2.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳不同上樣量

采用引物C13748對火龍果種質(zhì)R1和R2的DNA進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)不同上樣量的10%變性聚丙烯酰胺電泳結(jié)果圖分析發(fā)現(xiàn)（圖5），特異性和非特異性條帶的區(qū)分不受上樣量的影響。但當(dāng)上樣量為1.0μL（圖5中的A1、A2泳道）、1.5μL（圖5中的B1、B2泳道）和2.0μL時（圖5中的C1、C2泳道），擴增條帶較為模糊，不易辨認(rèn)。上樣量為2.5μL（圖5中D1、D2泳道），擴增條帶帶型清晰泳道背景淺，利于多態(tài)性位點統(tǒng)計。上樣量為3.0μL（圖5中E1、E2泳道）和3.5μL（圖5中F1、F2泳道），擴增條帶帶型仍可清晰辨認(rèn)，但有稍有彌散趨勢，泳道背景也有所加深。因此，最佳上樣量應(yīng)為2.5μL。

2.6 擴增體系穩(wěn)定性驗證

利用已經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)程序，選擇EST-SSR多態(tài)性引物C30929和C30192對采自貴州省果樹研究所種質(zhì)資源圃的11份火龍果種質(zhì)進(jìn)行10%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性擴增。擴增結(jié)果顯示，不同的引物均能夠擴增出清晰、明亮的目的條帶，表明本試驗所篩選的PCR擴增體系穩(wěn)定性好，可用于火龍果EST-SSR擴增反應(yīng)。

泳道1～11：11份火龍果種質(zhì)在10%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳擴增結(jié)果；M為DNA Marker。C30929和C30192 為引物。

3 結(jié)論與討論

目前火龍果已開發(fā)的分子標(biāo)記缺乏共顯性，尚不能滿足分子標(biāo)記輔助育種的需要。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建立的SSR標(biāo)記來源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不依賴于物種的全基因組信息，共顯性高，重復(fù)性好，可直接反應(yīng)基因的表達(dá)信息，且操作簡便、經(jīng)濟、信息量大[18]，是一種較為經(jīng)濟高效的DNA分子標(biāo)記開發(fā)策略，目前已被廣泛地應(yīng)用于種質(zhì)遺傳多樣性評價、親緣關(guān)系分析以及遺傳圖譜構(gòu)建[19]。由于EST- SSR 標(biāo)記易受反應(yīng)體系和擴增程序的影響，且EST-SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是基于 PCR反應(yīng)過程的，且各因素間又存在互作效應(yīng)[20]，因此，欲獲得清晰穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物，對EST-SSR-PCR反應(yīng)擴增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化是非常重要的。在整個EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)中，不僅涉及了 PCR 擴增體系中的各因子和擴增程序，而且涉及DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，其對試驗結(jié)果的影響也是極大的。DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是EST-SSR引物篩選與多態(tài)性檢測中一種比較普遍的電泳技術(shù)，與瓊脂糖凝膠電泳相比，所需樣品量小，分辨率較高，能分辨相差幾個堿基的核酸小片段[21]。因此廣泛應(yīng)用于多態(tài)性分析、樣品的分離和純度鑒定等方面，但是實驗過程操作復(fù)雜，影響因素較多。需要根據(jù)所分離的DNA片段長度配制不同分子質(zhì)量濃度的凝膠，摸索最佳的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件，為火龍果EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，采用單因素或正交試驗設(shè)計對Mg2 +濃度、dNTPs 濃度、Taq 用量、引物濃度的含量進(jìn)行優(yōu)化，建立SSR分子標(biāo)記體系的研究較多，如小桐子、小豆、木薯[22-24]等植物的SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立。近年來，2×Taq PCR Mix常用于PCR擴增反應(yīng)，是將PCR反應(yīng)所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液預(yù)先配制成2倍濃度的混合物。2×Taq Master Mix專為常規(guī)PCR擴增反應(yīng)優(yōu)化，擴增長度可達(dá)8 kb，能對4 kb及其以下長度的片段進(jìn)行高效地擴增。使用時只需再加入模板和引物即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，大大地簡化了操作過程，減少了PCR操作過程中的污染。而再單獨對Taq酶、dNTP混合物和MgCl2濃度的含量進(jìn)行優(yōu)化顯得有些繁瑣和多余。所以本試驗在優(yōu)化EST-SSR-PCR反應(yīng)體系過程中，用2×Taq PCR Mix，將dNTPs、Taq酶和Mg2+3個因素作為整體，綜合評價其對火龍果EST-SSR-PCR反應(yīng)體系的影響。最終篩選出最優(yōu)EST-SSR-PCR擴增反應(yīng)體系組合為14，即10 μL混合反應(yīng)體系含基因組DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR 引物，其余用ddH2O補足至10μL。

退火溫度決定 PCR特異性和產(chǎn)量，溫度過高引物不能與模板牢固結(jié)合，過低則容易使引物和模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加[25]?？赏ㄟ^設(shè)置一系列梯度，以確定某些反應(yīng)的特定退火溫度，本試驗設(shè)置5個溫度梯度（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），進(jìn)行PCR擴增，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終確定不同引物的最佳退火溫度。

利用不同質(zhì)量濃度變性聚丙烯凝膠對采自貴州省果樹研究所種質(zhì)資源圃內(nèi)的11份材料進(jìn)行電泳檢測發(fā)現(xiàn)，6%、8%和10%質(zhì)量濃度的凝膠對相同PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測產(chǎn)生的結(jié)果差異明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度為10%時，所獲得的擴增條帶最為清晰，能夠清楚的對條帶進(jìn)行判讀。當(dāng)質(zhì)量濃度為6%時，擴增產(chǎn)物聚集在一起，條帶無法區(qū)分開。在其它條件都相同時，質(zhì)量濃度較高的變性聚丙烯凝膠更容易將條帶相近的PCR產(chǎn)物分開，而在低濃度的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，條帶較彌散，不易分開，不利于基因型的判斷?；瘕埞N質(zhì)DNA通過引物C30929和C30192在已經(jīng)篩選出的擴增反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴增，然后采用10%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性擴增，均能擴增出清晰、明亮的目的條帶，表明本試驗所篩選的PCR擴增體系穩(wěn)定性好，可用于火龍果EST-SSR擴增反應(yīng)。此外，本試驗對上樣量進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，最佳上樣量為2.5μL，此時擴增條帶帶型清晰泳道背景淺。而上樣量過低時擴增條帶較為模糊，不易辨認(rèn)，上樣量過高則會出現(xiàn)條帶稍有彌散趨勢，泳道背景也有所加深，不利于條帶統(tǒng)計。

本研究通過正交試驗得到了火龍果穩(wěn)定的EST-SSR-PCR反應(yīng)體系（10μL）含基因組DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR 引物，其余用ddH2O補足至10μL。在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測中，利用10%的變性聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度、2.5μL上樣量擴增效果最佳。建立的火龍果 SSR-PCR 擴增的最佳反應(yīng)體系，可為火龍果種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析建立技術(shù)基礎(chǔ)。

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