張啟發(fā) 聶瓊 鄒序生 謝瑞 劉云鶴

摘 要：本文建立了一種可同時測定烤煙葉片中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的高效液相色譜（HPLC）檢測方法，并分析了不同煙草雜種F1及其親本中上述多酚的含量。采用甲醇：水=7∶3為提取液，超聲提取30 min，色譜柱為Agilent 5 TC-C18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm） ；2%冰乙酸水溶液-甲醇為流動相，梯度洗脫，流速1 ml/min；柱溫30℃；進樣體積10 μl。結(jié)果顯示：6種多酚類物質(zhì)分離效果良好，加樣回收率范圍在95.53%～100.622%（RSD為0.95%～2.285%），穩(wěn)定性RSD（n=3）為0.13%～1.73%。綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的線性范圍在10～600 μg/ml之間，各多酚類物質(zhì)線性方程相關(guān)系數(shù)在0.99996～0.99999之間。各材料的綠原酸和蘆丁含量較高，為多酚類物質(zhì)主要成分，其他多酚物質(zhì)含量則比較低。雜種F1相對其親本材料在某種多酚含量中表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，VA116 × GDH88綠原酸含量遠遠高于其兩個親本材料，VA116 × TN90蘆丁含量也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116，F(xiàn)lorida301 × GDH94蘆丁含量超越雙親，綠原酸含量則低于其親本GDH94。

關(guān)鍵詞：烤煙；HPLC；多酚；綠原酸；蘆丁

中圖分類號：S572

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0021-06 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.004

Simultaneous Determination of Six Polyphenols in Flue-cured Tobacco Leaves by HPLC Method

ZHANG Qifa1，2，NIE Qiong1，2*，ZOU Xushen1，2，XIE Rui1，2，LIU Yunhe1，2

（1. College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Tobacco Quality，Tobacco Research Center of Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was developed for the simultaneous determination of chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin， and kaempferol in flue-cured tobacco leaves. The content of these six polyphenols were analysed in the hybrid F1 and its parents for different tobaccos. The extraction solution of pure methanol：pure water =7：3 was used. Ultrasonic extraction was performed for 30min. Column T was Agilent 5 TC-C18 （250mmx4.6mm， 5 mm）. Two per cent of aqueous glacial acetic acid-methanol was used as the mobile phase. Gradient elution with the flow rate of 1ml/min was applied. Column temperature was at 30 C and injection volume was 10 L. The results showed that the six polyphenols had good separation effect. The rate of recovery ranged from 95.53% to 100.622% （RSD was 0.95% to 2.285%）， and the stability RSD （n=3） was 0.13% ～ 1.73%. Chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin and kaempferol was in the range of 10～600 g/ml. The correlation coefficients of the linear equation of polyphenols varied from 0.99996 to 0.99999. The content of chlorogenic acid and rutin in each material was relatively high， which was the main component of polyphenols. The content of other polyphenols is relatively low. Hybrid F1 had some advantages relative to its parent materials in certain polyphenol contents. For example， the content of chlorogenic acid of VA116 X GDH88 in hybrid F1 was much higher than that of its two parent materials； the content of rutin of VA116 X TN90 also surpassed the parents； while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent VA116； the content of rutin of Florda301 X GDH94 was also beyond that of the parents， while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent GDH94.

Key words：Tobacco polyphenols；HPLC；chlorogenic acid；rutin；method validation

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種以吸食為主要目的的特殊經(jīng)濟作物，其香味基本上決定了它的利用價值或可用性[1]。多酚類化合物是煙草的重要潛香物質(zhì)，烤煙中多酚含量可達7%；蕓香苷、綠原酸和莨菪亭是煙葉中最豐富的多酚，不僅對煙葉顏色有直接作用，而且對煙氣質(zhì)量和香氣有間接作用，可賦予煙氣清甜香、烤香[2]。 一般認(rèn)為，烤煙中多酚類物質(zhì)的含量與煙葉品質(zhì)、芳香吃味是一致的。多酚類物質(zhì)含量越高，煙草制品等級也就越高[3]。多酚類物質(zhì)主要存在于葉片中，莖和根部有少量積累[4]。莊亞東等[5]對煙草多酚類化合物研究發(fā)現(xiàn)：多酚化合物對煙株的生長發(fā)育、抗病蟲害、抗逆性有很大影響。韓景峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)：鮮煙葉中多酚與煙葉的易烤性也有很大關(guān)系。因此，測定分析煙草中多酚類物質(zhì)的含量，可為優(yōu)質(zhì)煙草品種的篩選、選育提供數(shù)據(jù)支撐。

HPLC法分析煙草中的多酚物質(zhì)，具有分離高效，測定準(zhǔn)確的優(yōu)點。目前已有HPLC法鑒定煙葉中綠原酸、蘆丁、莨菪亭等多酚物質(zhì)的相關(guān)報道[6-7] ，但還沒有同時測定煙葉中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的相關(guān)報道。超聲提取法是通過空化作用、熱效應(yīng)、機械作用使植物組織內(nèi)部的溫度瞬時升高，加速目標(biāo)成分的溶出[8-9]。超聲提取法具有效率高，不用加熱，可大大縮短提取時間，不會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的分解等優(yōu)點而得到廣泛推廣應(yīng)用[8，10]。因此，本文擬采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，優(yōu)化樣品提取法，建立適用于煙草樣品中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素等多種多酚物質(zhì)同時分析的方法，并在此基礎(chǔ)上分析幾個煙草品種（系）及其雜種F1的多酚類物質(zhì)，以期為篩選高多酚含量的煙草品種（系）和了解多酚物質(zhì)性狀雜種優(yōu)勢現(xiàn)象提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 引進品種VA116、Florida301和TN90，貴州大學(xué)自育烤煙品系GDH94和GDH88，雜種F1：GDH88×VA116，VA116 ×TN90，F(xiàn)lorda301 × GDH94，上述材料烤后C2F煙葉。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：綠原酸、咖啡酸、蕓香苷、莨菪亭、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海金穗生物科技有限公司；色譜純甲醇、分析純甲醇、乙酸購自貴州賽蘭博科技有限公司；水為娃哈哈純凈水。

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀； Agilent5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；臺式超聲清洗器PS-20；賽多利斯萬分之一電子天平。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜條件參照夏雅俊[10]建立的HPLC 法同時測定油橄欖葉中的 5 種多酚類化合物含量條件。流動相A為娃哈哈純凈水（加入2%的冰乙酸），流動相B為色譜純甲醇；流動相梯度為：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl；檢測波長100～600 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取4.8 mg綠原酸、4.9 mg蕓香苷、4.8 mg咖啡酸、5.0 mg莨菪亭、4.8 mg山奈酚標(biāo)準(zhǔn)對照品，用70%的甲醇溶液溶解，定容至100 ml，分別配制成48 μg/ml綠原酸、49 μg/ml蕓香苷、48 μg/ml咖啡酸、50 μg/ml莨菪亭及48 μg/ml山奈酚標(biāo)樣溶液母液，備用。分別移取標(biāo)樣母液1、2、3、5、10 ml，以70%的甲醇稀釋配成不同濃度的系列標(biāo)樣溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾待用。

1.2.3 線性關(guān)系和檢測限考察

將1.2.2所配置一系列不同濃度的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液用1.2.1的色譜條件進樣分析，進樣量為10 μl，進樣次數(shù)為2。以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行線性分析，得到各物質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。通過稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定每種多酚物質(zhì)的檢出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），線性范圍參照《JJG-705-2002-液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]中的方法進行確定。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

取一定質(zhì)量濃度的6種多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品于溫室放置，分別在0、2、4、6、8、10、24、48 h，按照相同的色譜條件進樣分析，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 樣品提取條件的優(yōu)化

以GDH94旺長期中部殺青葉片為材料，采用單因素實驗優(yōu)化煙葉中粗多酚的最佳提取條件。取煙草葉片粉末1 g，于100 ml容量瓶中，分別用娃哈哈純凈水配制純甲醇、95%甲醇、90%甲醇、85%甲醇、80%甲醇、75%甲醇、70%甲醇65%甲醇和60%甲醇作為提取試劑，超聲波清洗器超聲提取30 min，冷卻后溶液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾進樣測定。然后以量最高的提取液提取樣品，進行超聲時間的優(yōu)化，超聲時間分別為10、15、20、25、30、35和40 min。

1.2.6 提取回收率和精密度考察

稱取兩份相同GDH94材料5 g，其中一份加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，將兩樣品在相同條件下按照1.2.1的色譜條件進行HPLC分析，進樣3次重復(fù)試驗，通過標(biāo)曲方程算出各樣品濃度，計算出各種多酚類物質(zhì)的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 數(shù)據(jù)采集

在選定分析條件下，采用外標(biāo)法導(dǎo)出數(shù)據(jù)進行定量分析。分別采集六種多酚類物質(zhì)的光譜圖和色譜圖，及不同比例提取試劑和不同超聲時間所檢測出的各種多酚類含量進行對比分析。

1.2.8 樣品測定 分別稱取VA116，GDH88，GDH94，F(xiàn)lorda301，TN90，GDH88×VA116，VA116×TN90，F(xiàn)lorida301×GDH94的C2F煙葉粉末1.000 g于100 ml容量瓶中，定容。利用優(yōu)化的方法進行樣品測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種多酚光譜圖及色譜圖分析

利用單個標(biāo)準(zhǔn)品按照1.2.1的色譜條件進樣，采集光譜信息同時記錄保留時間。由圖1可以看出：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及咖啡酸的紫外吸收集中在200～350 nm之間，且各多酚物質(zhì)的光譜圖特征各有不同。由圖2 a可見，以流動相：水（2%的冰乙酸）-甲醇；流動相梯度：0 min A∶B=80∶20，25 min A∶B=50∶50，35 min A∶B=0∶100，45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl的運行體系可以很好的將6種多酚物質(zhì)給區(qū)分開來。與單個標(biāo)品的保留時間比對，獲得各酚類物質(zhì)的保留時間分別為：綠原酸9.702 min；咖啡酸12.151 min；莨菪亭16.511 min；蘆丁23.030 min；槲皮素30.763 min；山奈酚32.807 min。根據(jù)不同保留時間和光譜圖特征，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品進行光譜圖比對可以確定供試樣品的各個峰所代表的物質(zhì)（圖2b）。

2.2 不同比例提取試劑的影響

由圖3可以看出，煙葉中多酚類物質(zhì)以綠原酸和蘆丁含量最高，咖啡酸和山奈酚含量最低。甲醇濃度明顯影響多酚類物質(zhì)的提取效率。95%甲醇提取的綠原酸量比以100%純甲醇的提取量顯著增加，其中綠原酸提取量增加了153%，蘆丁提取量增加了46.67%，莨菪亭的提取量增加了188.53%，6種多酚總提取量增加了93.58%。甲醇∶水=70∶30時，煙葉中多酚類物質(zhì)提取率最高；隨著甲醇濃度的降低，提取效果沒有明顯增加，甚至略有下降。

2.3 不同超聲時間對烤煙多酚含量提取的影響

如圖4所示，超聲萃取時間與提取效果存在一定的關(guān)系，隨著超聲萃取時間延長，提取量有所增加，超聲時間30 min時，提取量已基本穩(wěn)定，超聲時間為30 min時，綠原酸提取量比超聲時間為10 min時增加了6.01%，蘆丁提取量增加了5.80%；莨菪亭提取量增加了0.27%，總含量較超聲時間為10 min時增加了5.5%。繼續(xù)延長超聲時間，各多酚物質(zhì)提取量增加不再明顯，采用30 min為超聲提取時間。

2.4 線性關(guān)系和檢測限考察

將1.2.2所配制一系列不同濃度的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用1.2.1的色譜條件進樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各物質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表 1）。通過稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定每種多酚物質(zhì)的檢出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），線性范圍參照《JJG-705-2002-液相色譜儀檢定規(guī)程》[11]中的方法進行確定。結(jié)果表明綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚6個物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R均大于0.9999；檢測限分別為2.51、0.20、5.62、1.19、0.15、0.12 μg/ml，定量限分別為8.38、0.69、16.32、3.64、0.56、0.42 μg/ml，顯示該方法具有較高的靈敏度，可對多酚類物質(zhì)含量較低的樣品進行分析。

2.5 提取回收率與精密度實驗

稱取兩份相同材料，按照1.2.3的方法進行回收率和精密度試驗結(jié)果如由表2所示。由表2可知，6種多酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率為95.53%～100.622%，RSD為0.95%～2.285%（n=5），說明所建立的方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取1.2.5中70%提取超聲時間為30 min的供試樣品適量，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、16、24、48 h，按1.2.1色譜條件測定，記錄峰面積。計算RSD，結(jié)果供試樣品綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素、山奈酚RSD分別為1.43%、0.89%、1.65%、1.11%、0.55%、0.79%（n=5），表明供試品室溫放置48 h內(nèi)基本定性。

2.7 供試材料多酚類物質(zhì)含量檢測

表3結(jié)果顯示不同材料中不同多酚物質(zhì)含量不同，各材料的綠原酸和蘆丁含量較高，其他多酚物質(zhì)含量較低；其中GDH88×VA116中多酚類物質(zhì)總含量最高，達14.51mg/g，綠原酸含量（11.74mg/g）也顯著高于其他材料。TN90的多酚類物質(zhì)總含量、綠原酸和蘆丁的含量都最低。各雜交種相對其親本材料在某種多酚含量中都有一定優(yōu)勢，如GDH88×VA116在綠原酸含量上遠遠高于其兩個親本；VA116 × TN90在蘆丁含量上也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116；Florda301 × GDH94在蘆丁含量上也超越了雙親，在綠原酸含量上則低于其親本GDH94。

3 結(jié)論與討論

本文通過對提取試劑、超聲時間的優(yōu)化，建立了同時檢測煙草多酚類物質(zhì)綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚的高效液相色譜法：流動相A為娃哈哈純凈水（加入2%的冰乙酸），流動相B為色譜純甲醇；流動相梯度為：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μl；檢測波長100～600 nm。提取試劑選擇70%的甲醇，超聲時間為30 min。

驗證表明：應(yīng)用該方法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性非常好，相關(guān)系數(shù)為0.99996～0.99999，回收率95.53%～100.622%的范圍，說明方法準(zhǔn)確可信；變異系數(shù)低于2%，說明方法重現(xiàn)性好；穩(wěn)定性試驗RSD在0.55%～1.43%之間，說明所采用提取方法提取的6種多酚類物質(zhì)比較穩(wěn)定。所優(yōu)化的方法可以用于高效液相色譜法檢測煙草葉片中多酚類物質(zhì)含量。

利用所建立的方法檢測了3個雜種F1及其親本材料的多酚類物質(zhì)含量，結(jié)果表明綠原酸和蘆丁是煙葉多酚物質(zhì)的主要成分，咖啡酸、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的含量較低。不同樣品之間的綠原酸含量差異較大，在0.25～11.74之間。同一品系不同時期的綠原酸含量也不同，在優(yōu)化提取試劑時，采用的是GDH94 旺長期的殺青葉片為材料，此時的綠原酸及蘆丁的含量都顯著低于成熟期烤后煙葉的含量。雜交種相對其親本材料在某種多酚含量中都有一定優(yōu)勢；GDH88×VA116在綠原酸含量上遠遠高于其兩個親本材料；VA116 × TN90在蘆丁含量上也超越其雙親，而綠原酸含量則低于其親本VA116；Florda301 × GDH94在蘆丁含量上也超越了雙親，在綠原酸含量上則低于其親本GDH94。

綠原酸是抗菌、抗病毒、抗低血壓以及治療肥胖的有效藥理成分之一[12-13]。蘆丁也具有抗氧化、消除自由基、保護心腦血管等作用[14]。在醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域都具有光明的應(yīng)用前景。從雜交種的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)來看，綠原酸和蘆丁都存在較為明顯的超親優(yōu)勢現(xiàn)象，這可能是雜交種中控制苯丙素生物合成途徑和黃酮類生物合成途徑的單個基因表達或多個基因互作調(diào)控引起的。因此，可從基因?qū)用孢M一步研究、利用雜種優(yōu)勢培育高含量的綠原酸和蘆丁的煙草雜交種，拓展煙草的綜合利用價值。

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