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大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

2018-07-13 03:50:18周可柔胡倩倩靳二輝顧有方李升和
關(guān)鍵詞:生精貼壁純度

張 倩, 周可柔, 胡倩倩, 任 曼, 靳二輝, 顧有方, 李升和

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

支持細(xì)胞(Sertoli cell),在精子發(fā)生和成熟過(guò)程中,具有支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)生精細(xì)胞作用,促進(jìn)雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein,ABP)合成,ABP可與雄激素結(jié)合,以保持生精小管內(nèi)雄激素水平,進(jìn)而促進(jìn)精子發(fā)生[1],使支持細(xì)胞體外培養(yǎng)研究成為探究雄性生殖細(xì)胞的基礎(chǔ),在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。20世紀(jì)90年代初,Cameron創(chuàng)立了睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法[2],目前國(guó)內(nèi)外采用方法均由其沿襲而來(lái),但由于其方法復(fù)雜,操作步驟繁雜、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)細(xì)胞損傷大、睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)量低;另外39 ℃下培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞造成損傷,睪丸支持細(xì)胞活性低,不利于開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者針對(duì)這些缺陷進(jìn)行了許多改良,曹博等采用睪丸酶次第消化制成細(xì)胞懸液后[4],于37 ℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用胰蛋白酶和DMEM/F-12培養(yǎng)液吹打,有效去除了生精細(xì)胞和其他貼壁細(xì)胞,比39 ℃高溫培養(yǎng)和低滲法去除生精細(xì)胞方法簡(jiǎn)便,并且獲得支持細(xì)胞濃度達(dá)到90%以上[5]。

在睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)中,提高分離培養(yǎng)支持細(xì)胞純度一直是其重點(diǎn)所在[6]。從睪丸組織中獲得高純度支持細(xì)胞可以采用機(jī)械分離法和酶法[7-10]。機(jī)械分離法難以獲得大量高純度細(xì)胞,酶法是體外培養(yǎng)時(shí)分離細(xì)胞最有效的方法[11]。本試驗(yàn)采用兩步酶單次消化法,在前人研究的基礎(chǔ)上縮短了酶消化時(shí)間,減少了對(duì)細(xì)胞的損傷,在37 ℃水浴震蕩消化過(guò)程中可使睪丸曲細(xì)精管充分消化,細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(PBS)輕輕洗滌并更換新的完全培養(yǎng)液,提高細(xì)胞的收獲量和純度,同時(shí)在兩步酶消化過(guò)程中可充分去除睪丸中的成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物3月齡清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠(許可證號(hào):SCXK(浙)2014-0001),購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)大鼠按照雌∶雄(3∶1)進(jìn)行交配繁殖,飼養(yǎng)于全膜終端獨(dú)立通氣籠盒(Individual ventilated cages,IVC)內(nèi),嚴(yán)格按照IVC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。環(huán)境溫度25~27 ℃,濕度55%~63%,光照12 h,飼喂顆粒飼料及蒸餾水,自由飲水和采食。試驗(yàn)用于交配繁殖生長(zhǎng)的18~22日齡的雄性SD大鼠。

1.1.2試驗(yàn)飼料試驗(yàn)飼料:試驗(yàn)大鼠顆粒飼料(檢驗(yàn)報(bào)告編號(hào):2017-X-7386),購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)。其營(yíng)養(yǎng)水平為:粗蛋白≥18.15%,粗脂肪≥4.03%,粗纖維≥5.12%,粗灰分7.94%,鈣1.43%,磷0.87%,硼1.96 mg/kg。

1.1.3試驗(yàn)試劑蘇木精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,北京)、伊紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,北京)、DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone,美國(guó))、胎牛血清(HyClone,美國(guó),F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素(Biosharp,美國(guó))、PBS(HyClone,美國(guó))、0.25%胰酶(GBICO,美國(guó))、膠原酶IV型(Biosharp,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)取交配繁殖的18~22 d雄性大鼠,頸椎脫臼致死,全身浸泡于75%酒精中,紫外燈下照射10 min,無(wú)菌操作取睪丸并置于預(yù)先加入4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS培養(yǎng)皿中,兩次清洗睪丸表面黏液和血液,用眼科剪和眼科鑷去除睪丸被膜及睪丸實(shí)質(zhì)中的血管;然后置于青霉素瓶中,加入預(yù)冷PBS 3 mL,用眼科剪將睪丸實(shí)質(zhì)剪碎為約1 mm3的碎塊,靜置3 min,用移液槍將上清液棄去,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中;加入相當(dāng)于離心管中睪丸實(shí)質(zhì)4倍體積的0.25%胰酶,輕輕震蕩,使睪丸實(shí)質(zhì)中的曲精小管散開(kāi);37 ℃水浴消化15 min,期間每隔2 min震蕩一次,觀察組織碎塊消化成線索狀,加入1 mL FBS終止消化,1500 r/min離心5 min,棄上清液,再加5 mL PBS用1 mL移液槍輕輕吹打懸浮細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min棄上清液;加入相當(dāng)于離心管中睪丸實(shí)質(zhì)4倍體積的0.1% IV型膠原酶,37 ℃水浴消化10 min,每隔2 min震蕩一次,觀察組織變成黏液狀,再加入1 mL FBS終止消化,經(jīng)100目金屬網(wǎng)篩過(guò)濾收集濾液于離心管中,800 r/min離心5 min棄上清,再加入10 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含100 IU/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+10% FBS),用1 mL移液槍輕輕吹打懸浮細(xì)胞,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。接著將細(xì)胞濃度調(diào)整為(0.5~1)×106/mL,接種于25 mL培養(yǎng)瓶中(5 mL/瓶),輕輕晃動(dòng),使細(xì)胞分散均勻,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察;然后用PBS輕輕洗滌一次,更換DMEM高糖完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)3 d待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的85~95%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2支持細(xì)胞免疫熒光鑒定取分離培養(yǎng)所得細(xì)胞,制備細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定。固定好的細(xì)胞爬片,用含0.1% Tris-HCl的PBS洗3次(Vimentin蛋白需要破膜,在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)),每次5 min;3% H2O2室溫處理15 min;PBS洗3次,每次5 min;滴加一抗Vimentin Antibody (1∶1000) 4 ℃過(guò)夜;室溫平衡30 min;PBS洗滌3次,每次5 min;滴加Alexa Fluro 488-conjugated Affinipure G(H+L)二抗,37 ℃孵育2 h,PBS洗滌3次,每次3 min;加DAPI染15 min,PBS洗滌3次,每次3 min,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3不同代支持細(xì)胞HE染色取不同代細(xì)胞,制備細(xì)胞爬片。PBS洗滌3次,每次2 min,95%乙醇固定20 min,PBS洗滌2次,每次1 min,蘇木精染液染色2.5 min,蒸餾水沖洗,1%鹽酸酒精分色5 s,自來(lái)水藍(lán)化,伊紅染色2 min, 70%、80%、90%梯度乙醇各洗滌一次,每次1 min,95%、100%乙醇洗滌2次,每次1 min,二甲苯洗滌3次,每次1 min,中性樹(shù)膠封片,在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vimentin免疫熒光鑒定睪丸支持細(xì)胞

以Vimentin表達(dá)陽(yáng)性為支持細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。由圖1可知,熒光顯微鏡下藍(lán)色熒光橢圓形結(jié)構(gòu)為支持細(xì)胞的細(xì)胞核(圖1 B);綠色熒光為Vimentin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)構(gòu),主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),且Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率 > 95%(圖1 A),表明該分離培養(yǎng)的細(xì)胞為睪丸支持細(xì)胞,其純度達(dá)到95%以上(圖1 C)。

圖1 支持細(xì)胞Vimentin免疫熒光鑒定(400 ×;A.細(xì)胞質(zhì)中Vimentin陽(yáng)性表達(dá);B.細(xì)胞核DAPI染色;C.A與B疊加圖片 )

2.2 睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)變化

倒置相差顯微鏡觀察可見(jiàn),剛分離的支持細(xì)胞體積較小、呈圓形、折光性強(qiáng)(圖2 A)。培養(yǎng)24 h后,可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)突起并貼壁長(zhǎng)出,細(xì)胞周邊有光圈現(xiàn)象,同時(shí)可見(jiàn)少部分圓形細(xì)胞懸浮于細(xì)胞瓶中(圖2 B);培養(yǎng)48 h后,可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞均已貼壁,細(xì)胞扁平、形態(tài)不規(guī)則,胞體增大并可見(jiàn)多個(gè)突起,少部分細(xì)胞開(kāi)始呈膜狀鋪在培養(yǎng)瓶壁上,懸浮的細(xì)胞明顯減少近乎消失,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)更加明顯(圖2 C);培養(yǎng)72 h后更換完全培養(yǎng)基,觀察可見(jiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞體積明顯增大,細(xì)胞質(zhì)增多,細(xì)胞之間融合成片,折光性減弱,細(xì)胞核更加明顯,懸浮的細(xì)胞消失,此時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)(圖2 D)。

圖2 睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)化 (100 ×;A:1 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h)

2.3 睪丸支持細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)變化

倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞及光鏡下觀察HE染色細(xì)胞爬片(圖3)可見(jiàn),分離培養(yǎng)的第1代睪丸支持細(xì)胞貼壁伸展的形態(tài)不均勻,胞體伸出的突起較少,細(xì)胞間連接不緊密,并有少量細(xì)胞懸浮(圖3 A、E、I)。第2、3代睪丸支持細(xì)胞貼壁形態(tài)趨于穩(wěn)定并且分布較為均勻,細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快,細(xì)胞體積增大、胞質(zhì)豐富,胞核呈卵圓形;細(xì)胞突起增多、排列緊密、相互間連接呈片狀(圖3 B、F、J;圖 3 C、G、K);第4代睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢,細(xì)胞突起萎縮,胞體體積變小,胞核固縮或變形裂解,細(xì)胞分散排列(圖3 D、H、L)。鑒于以上結(jié)果,試驗(yàn)將選用細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定、增殖速度較快的第2、3代睪丸支持細(xì)胞為佳。

圖3 睪丸支持細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

3 結(jié)論與討論

睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多,但目前國(guó)內(nèi)分離培養(yǎng)支持細(xì)胞的方法均較復(fù)雜繁瑣,包括稱量睪丸濕重、2次消化及過(guò)濾、多次離心等,其操作步驟多,所需時(shí)間長(zhǎng),分離培養(yǎng)的支持細(xì)胞純度為80%左右[12]。此外,由于睪丸支持細(xì)胞在睪丸中所占比例很低,因此分離的純度常受到生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的影響[13]。試驗(yàn)顯示,胚胎鼠睪丸中生精細(xì)胞較少或不存在,支持細(xì)胞的純度很高但睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)量亦較低;成年鼠睪丸中含有大量的生精細(xì)胞,故分離所得睪丸支持細(xì)胞純度較低[14]。金向陽(yáng)等研究選用28~30日齡wistar大鼠,所分離培養(yǎng)得到的支持細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的80%左右[15]。王煒等采用16~22日齡SD大鼠處于青春前期至青春期,分離得到的睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到90%[16]。本試驗(yàn)選用18~22日齡SD雄性大鼠,因該日齡段大鼠睪丸尚未下降到陰囊,仍在腹腔,故支持細(xì)胞分離較為簡(jiǎn)單,并且比較容易純化,分離的細(xì)胞生長(zhǎng)速度也較快,分離純化后支持細(xì)胞的數(shù)量較多。

不同的分離方法得到的睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量和純度也不相同,實(shí)驗(yàn)室中常采用機(jī)械法和酶消化法[10]。有的學(xué)者采用單一酶消化法,有的采用組合酶消化法,還有采用酶消化法與機(jī)械法共同作用[17-18]。本試驗(yàn)分離過(guò)程采用胰酶和Ⅳ型膠原酶37 ℃水浴震蕩消化,從而縮短了消化時(shí)間,減少了對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷,且細(xì)胞消化徹底,分離得到的支持細(xì)胞數(shù)量較多,純度較高。此外,培養(yǎng)24 h時(shí)用預(yù)冷PBS輕輕洗滌一次,加入新的培養(yǎng)液,可以去除部分未貼壁的其他細(xì)胞,在細(xì)胞長(zhǎng)滿85%以上進(jìn)行傳代,純化細(xì)胞,此步驟簡(jiǎn)化了以前學(xué)者采用39 ℃高溫培養(yǎng)和低滲法去除生精細(xì)胞的方法。

分離培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞常用HE染色、甲基綠-派洛寧染色和Feulgen染色和透射電鏡可以鑒定支持細(xì)胞[19]。其中Feulgen染色主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞核中的衛(wèi)星核小體,該鑒定方法條件苛刻,穩(wěn)定性差,常需要反復(fù)試驗(yàn)才能獲得理想的染色效果[20],為了克服Feulgen染色鑒定方法穩(wěn)定性差缺點(diǎn),常采用免疫標(biāo)記法鑒定支持細(xì)胞,如FAS-L、P-胎盤鈣黏蛋白或波形蛋白標(biāo)記法等[21-22]來(lái)鑒定睪丸支持細(xì)胞。本文采用Vimentin免疫熒光鑒定,Vimentin蛋白與Vimentin抗體特異性結(jié)合,可見(jiàn)95%的細(xì)胞Vimentin陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為睪丸支持細(xì)胞,且細(xì)胞純度達(dá)95%以上。倒置相差顯微鏡下觀察,本試驗(yàn)分離的大鼠睪丸支持細(xì)胞在培養(yǎng)6 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng),培養(yǎng)24 h后,大多數(shù)支持細(xì)胞已經(jīng)貼壁,細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形,少部分支持細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)呈長(zhǎng)柱型或梭形,細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,還有少數(shù)細(xì)胞懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)瓶上。這與韓曉冬等人分離的大鼠睪丸支持細(xì)胞形態(tài)一致,細(xì)胞培養(yǎng)24 h之后,大多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始貼壁,細(xì)胞形狀呈圓形或橢圓形,培養(yǎng)液中漂浮著較多生精細(xì)胞[23]。

綜上所述,本試驗(yàn)通過(guò)改進(jìn)大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法可獲得大量純度較高、活性較好的睪丸支持細(xì)胞,這為后續(xù)的試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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