肖明松，　鮑方印，　康　健

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽　233100)

日本沼蝦(Macmbrachiumnipponensis) 俗稱青蝦，又名河蝦、沼蝦，為節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目游泳蝦亞目長臂蝦科沼蝦屬，廣泛分布于我國各地的江河、湖泊、水庫、池塘及溝渠中，是我國淡水天然蝦類中的一個(gè)重要種群，也是我國淡水養(yǎng)殖的重要蝦類之一。其市場(chǎng)銷售量經(jīng)久不衰，深受消費(fèi)者青睞[1-3]。青蝦具有適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖力高等特點(diǎn),與其他甲殼類水產(chǎn)品相比[4-5]，如河蟹，青蝦具有營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美[6]，易消化，食用方便且蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn)。另外青蝦體內(nèi)含有豐富的鎂離子，可以有效預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生，并且青蝦具有增強(qiáng)記憶力的功效[7]。近年來，由于農(nóng)村地區(qū)工業(yè)化的發(fā)展，很多地區(qū)建立起了許多化工廠，污水排放，生活垃圾等嚴(yán)重影響了青蝦的生長環(huán)境[8]。在日本沼蝦養(yǎng)殖過程中由于長期捕大留小、忽視良種選育以及過度捕撈野生資源，使得日本沼蝦野生資源逐漸衰竭，養(yǎng)殖日本沼蝦出現(xiàn)了個(gè)體小型化、性早熟以及生長速率慢等種質(zhì)退化現(xiàn)象[4,9]。目前，其研究大多數(shù)集中在其分類[1-3]、生活習(xí)性[6]、繁殖和養(yǎng)殖等方面的研究[10-11]，而關(guān)于其種群遺傳和分子進(jìn)化方面的研究相對(duì)較少[4,12-13]，尤其關(guān)于淮河流域青蝦的分子生物學(xué)研究更少。因此，研究淮河流域青蝦細(xì)胞色素氧化酶I基因序列為后期青蝦的種質(zhì)資源保護(hù)以及青蝦養(yǎng)蝦業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　材料

青蝦取自淮河蚌埠段，蝦齡10個(gè)月左右，全長為8～12 cm，體重15～20 g，將受試材料用95%的乙醇固定后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃冰箱冷凍保存以備用。

1.2　方法

1.2.1模板DNA 的制備采用苯酚-氯仿法提取淮河青蝦背部肌肉組織的基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度，同時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA 的完整性并估測(cè)分子量?；蚪MDNA樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2PCR反應(yīng)用于青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I序列擴(kuò)增的兩條引物為: LCO1490 (5- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3)和HCO2198 (5- TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3)[15]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中含10×buffer反應(yīng)緩沖液3.0 μL，3 μL dNTP (2.5 mmol/L)，引物L(fēng)CO1490和HCO2198各1.2 μL，0. 3 μL Taq 酶，模板DNA 1.0 μL，加滅菌蒸餾水至30.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3PCR產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)定和分析 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳PCR 產(chǎn)物，電泳結(jié)果在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS)中拍照，保存。同時(shí)，將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果分別在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索驗(yàn)證。用Clustal X 2.11軟件[16]進(jìn)行堿基比對(duì)，輔以人工校對(duì)。將獲得的序列與GenBank 中已有的青蝦線粒體DNA全序列(HQ 830201)進(jìn)行同源性比較。最后，利用MEGA 4.1 軟件包分析序列特征、堿基組成等[17]，并計(jì)算堿基偏倚性。

2　結(jié)果與分析

2.1　青蝦基因組DNA電泳檢測(cè)

青蝦總基因組DNA凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。由圖1可知，青蝦總基因組DNA條帶清晰、整齊、較完整、有拖尾，說明DNA片斷有降解，含有一定雜質(zhì)。目的片斷大于2000 bp，說明提取的總基因DNA分子量較大。

圖1　青蝦總DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2　青蝦線粒體DNA Cyt b基因全序列PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)。由圖2可知，引物L(fēng)CO1490和 HCO2198在青蝦不同肌肉組織中均能擴(kuò)增到線粒體細(xì)胞色素氧化酶I序列序列條帶，細(xì)胞色素氧化酶I序列條帶電泳圖譜條帶清晰、明亮，線粒體細(xì)胞色素氧化酶I的片段大于1000 bp。這可說明苯酚-氯仿法提取的青蝦肌肉組織DNA 質(zhì)量較高，能夠用于后期的群體遺傳學(xué)研究。

圖2　青蝦細(xì)胞色素氧化酶I的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.3　青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I全序列

圖3　青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I全序列

青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I全序列長度為1 535 bp，編碼蛋白含511個(gè)氨基酸。其中A、T、C和G 4種堿基分別為459個(gè)、471個(gè)、345個(gè)和260個(gè)，它的起始密碼子為ACG，終止密碼子為TA。青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因序列(圖3)。

2.4　青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I的密碼子堿基使用

由表1可知，青蝦細(xì)胞色素氧化酶I序列平均堿基組成 A、T、C及G分別為 30.0%、30.6%、22.5%及16.9%；4種堿基在密碼子的第1位上使用較為均衡；堿基T在密碼子第2位上的使用率比較高(40.6%)，而堿基G的使用比率則降低(16.0%)；堿基A在密碼子第3位上的使用比率最高(45.8%)，堿基G的使用比率最低，僅為5.7%。A+T的堿基百分比總體上大于C+G，平均值分別是60.6%和39.4%。

表1　青蝦細(xì)胞色素氧化酶I的密碼子堿基使用情況

3　結(jié)論與討論

青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因序列與其它沼蝦的細(xì)胞色素氧化酶I基因序列相比，具有較高的同源性。青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因全序列為1 535 bp，含起始密碼子ACG和終止密碼TA。其中，細(xì)胞色素氧化酶I基因的終止密碼子為不完全的終止密碼子TA，但通過轉(zhuǎn)錄加工過程中的多聚腺苷酸化，從而形成完整的TAA終止密碼子[13]。邵愛華等研究硬骨魚亞綱1315 種魚類COI 由1545～1593 個(gè)堿基組成，編碼514～530 個(gè)氨基酸。COI 基因序列中沒有發(fā)現(xiàn)任何堿基的缺失或插入。15 種魚類COI 基因的起始密碼均為GTG，與其他基因的起始密碼子不同[18]。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，A、T、C、G四種堿基分別含有數(shù)目459、471、345、260，占總序列堿基的比例為30.0%、30.6%、22.5%、16.9%，A、T含量明顯較多，且A+T的含量(60.6%)明顯高于C+G的含量(39.4%)。這一特征和已報(bào)道3種沼蝦類[19]和中華絨螯蟹線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因序列的堿基分布相似[20]。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)兩種甲殼綱動(dòng)物有一個(gè)共同遺傳分子學(xué)的特征：它們細(xì)胞色素氧化酶I基因序列的A+T的含量都明顯高于C+G的含量，且G含量都表現(xiàn)最低。由于物種的不同，它們的COI序列基因長度存在明顯的不同，各堿基出現(xiàn)的比例也不相同。青蝦線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因的密碼子堿基使用存在偏倚性，如堿基A在密碼子第3位含量為45.8% ，而堿基G的含量僅為5.7%，密碼子第3位反G堿基偏倚分布在其他物種中也被發(fā)現(xiàn)，而在一些進(jìn)化高級(jí)的物種細(xì)胞色素氧化酶I基因則發(fā)現(xiàn)密碼子第3位具有對(duì)A和C極強(qiáng)偏倚特征[21]，這可能是由于蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸突變?cè)诿艽a子第三位點(diǎn)上受到的自然選擇壓力較小所致，證明密碼子第三位點(diǎn)能夠更清晰地表明線粒體基因組核苷酸組成的不均一性[22]。