李 鵬 張 琳 葉吉妮 賀詩瑤 賈軍偉 潘愛虎,* 唐雪明,*

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 / 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室, 上海 201106; 2 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200433;3 萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 山東萊蕪 271100; 4 臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江臺州 318000

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院通過基因槍轉(zhuǎn)基因方法將包含Xa21基因的質(zhì)粒pC822和潮霉素抗性基因hpt的質(zhì)粒pHX4轉(zhuǎn)入優(yōu)良恢復(fù)系明恢63, 得到轉(zhuǎn)基因品系M12。M12對中國所有白葉枯病小種都表現(xiàn)出高度抗性, 通過多代回交和分子標(biāo)記輔助選擇, 以M12為親本, 培育得到多個抗白葉枯病水稻組合品系皖 21B、皖 21A和抗優(yōu) 97(皖21A×R-18)等[1]。農(nóng)業(yè)部發(fā)布了轉(zhuǎn)基因水稻M12及其衍生品種的定性PCR檢測方法[2], 但目前M12事件特異性的定量 PCR檢測方法尚未建立。為了便于對轉(zhuǎn)基因水稻 M12進(jìn)行定量檢測和分析, 需要建立準(zhǔn)確、特異的轉(zhuǎn)基因水稻 M12事件特異性檢測方法。

目前, 用于轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品檢測的方法主要有兩種, 一種基于核酸的檢測, 一種基于蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測。在轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的檢測過程中, 以DNA檢測為基礎(chǔ)的核酸檢測已經(jīng)成為最主要、最適用的方法?；贒NA的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)除了傳統(tǒng)的定性 PCR和定量PCR檢測技術(shù)之外, 等溫擴(kuò)增技術(shù)[3]、基因芯片技術(shù)[4]、數(shù)字 PCR技術(shù)[5]和生物傳感器檢測技術(shù)[6-7]獲得快速發(fā)展和應(yīng)用, 但這些新技術(shù)同時也存在一些問題和不足。等溫擴(kuò)增技術(shù)具有快速、特異、敏感等特點, 但其擴(kuò)增產(chǎn)物易污染, 引物間非連續(xù)配對的假陽性問題亟待解決[8]?；蛐酒夹g(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性的優(yōu)點, 但是儀器設(shè)備昂貴, 操作復(fù)雜, 需要特殊的消耗品, 增加了使用成本。生物傳感器檢測技術(shù)能夠?qū)崟r顯示采集數(shù)據(jù),無需放射性或熒光物質(zhì)標(biāo)記, 可以對相互作用的反應(yīng)動力學(xué)、結(jié)合親和力和樣品濃度進(jìn)行分析, 但其應(yīng)用受到穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命的限制, 再加上轉(zhuǎn)基因生物成分的復(fù)雜性, 使商業(yè)化的生物傳感器數(shù)量受到制約[9]。而定性、定量PCR檢測技術(shù)具有低成本、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作相對簡單等特點, 成為國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)部公告及出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等推薦的主要的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)被廣泛采用[10]。目前基于 DNA的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法經(jīng)歷了 4個發(fā)展階段, 即篩選特異性檢測、基因特異性檢測、構(gòu)建特異性檢測和品系(轉(zhuǎn)化事件)特異性檢測[11]。其中事件特異性檢測方法是針對特定轉(zhuǎn)化事件的, 具有高度特異性, 已成為國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法的發(fā)展趨勢。本研究旨在建立抗病轉(zhuǎn)基因水稻M12及其加工品的品系特異性定性、定量PCR檢測方法, 為抗病轉(zhuǎn)基因水稻M12的進(jìn)口檢測、國內(nèi)監(jiān)管及環(huán)境安全評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號和旱恢3T, 非轉(zhuǎn)基因水稻旱優(yōu) 3號由上海市農(nóng)業(yè)基因中心提供; 轉(zhuǎn)基因水稻M12和非轉(zhuǎn)基因水稻花優(yōu)14由本實驗室提供。

1.2 DNA的提取與純化

參照 Li等[12]方法提取和純化試驗材料 DNA。采用微量紫外可見分光光度計 Nano Drop ND1000(Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., Madison)測定DNA濃度和純度。

1.3 轉(zhuǎn)基因水稻M12質(zhì)粒分子的構(gòu)建

將水稻內(nèi)源基因蔗糖磷酸合酶基因(sucrose phosphate synthase,sps)檢測序列(277 bp)和外源基因旁鄰序列(380 bp)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 連接到pMD18-T, 得到質(zhì)粒分子pM12。具體構(gòu)建方法及步驟如下: (1)使用引物sps-F/R[13]和M12-SF/SR[2]擴(kuò)增M12水稻基因組 DNA, 采用膠回收試劑盒AP-GX-250 (愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)純化回收擴(kuò)增片段, 采用Zhang等[14]方法將 2個片段基因融合, 用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切回收產(chǎn)物, 連接到載體 pMD18-T, 得到質(zhì)粒, 命名為pM12。(2) pM12轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行增殖和后續(xù)試驗。(3)委托生工生物工程(上海)股份有限公司對 pM12測序確認(rèn)。分別采用引物sps-F/R和M12-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 驗證其作為轉(zhuǎn)基因水稻M12定量分析的標(biāo)準(zhǔn)分子。(4)采用膠回收試劑盒 AP-GX-250凝膠回收 pM12, 用分光光度計測量質(zhì)粒 DNA 質(zhì)量數(shù)。根據(jù)質(zhì)粒分子大小, 將質(zhì)粒質(zhì)量數(shù)換算成拷貝數(shù)。將pM12梯度稀釋, 用于標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和方法重復(fù)性評估。

1.4 事件特異性引物設(shè)計

根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻M12插入載體與旁鄰序列信息[2],應(yīng)用軟件 Primer Express Software Version 3.0(Thermo Fisher Scientific, Co., Ltd.)設(shè)計事件特異性PCR引物M12-F/R (表 1), 采用蔗糖磷酸合酶基因(sucrose phosphate synthase,sps)[13]作為水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因(表 1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增靶標(biāo)序列及引物如圖1。

表1 定性、定量PCR反應(yīng)所用引物Table 1 Primers used in qualitative (quantitative) PCR systems

圖1 抗病水稻M12特異性序列Fig. 1 Specific sequence of genetically modified rice M12

1.5 定性PCR檢測

定性PCR反應(yīng)體系包含10×PCR buffer (寶生物工程(大連)有限公司) 3 μL, 2 mmol L–1dNTP 3 μL,正、反向引物M12-F/R (10 μmol L–1)各 2 μL, 5 U μL–1TaqDNA polymerase 0.3 μL, 模板 DNA 2 μL, 加蒸餾水補(bǔ)充至30 μL。定性PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性, 5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸7 min。

1.6 定量PCR檢測

定量PCR反應(yīng)體系含2×SYBR Premix ExTaqII 5 μL (寶生物工程(大連)有限公司), 50×Rox Reference dye 0.2 μL, 正、反向引物M12-F/R (10 μmol L–1)各0.4 μL, 模板DNA 4 μL。定量PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性, 5 min; 94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s (收集熒光信號), 40個循環(huán)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

提取質(zhì)粒DNA用Easy Dilution緩沖液(寶生物工程(大連)有限公司), 依次稀釋至 10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、1000、100、10、5 拷貝, 以此為標(biāo)準(zhǔn)品分別擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因sps和M12品系特異性基因, 設(shè)置每個梯度3個平行重復(fù), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期設(shè)定閾值, 使任何2個樣品間的相對Ct值(ΔCt)保持不變, 計算不同樣本間基因表達(dá)的倍數(shù)變化, 并依標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析。本研究中, 內(nèi)標(biāo)基因sps和M12品系特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線閾值分別為6.8023和0.4097。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件(IBM Group, Inc)處理定量檢測體系重復(fù)性的數(shù)據(jù), 分析其Ct值的平均值(mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病轉(zhuǎn)基因水稻M12質(zhì)粒分子的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)基因水稻 M12的旁側(cè)序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因sps檢測序列插入質(zhì)粒pMD18-T, 得到3349 bp質(zhì)粒分子pM12。對質(zhì)粒pM12分別進(jìn)行旁鄰序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 PCR擴(kuò)增, 電泳結(jié)果如圖 2, 得到 2個條帶258 bp和277 bp。對pM12測序, 得到的序列與預(yù)期一致, 證明該質(zhì)粒為構(gòu)建正確的pM12質(zhì)粒。提取和純化質(zhì)粒pM12的DNA, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子基因組DNA的大小和平均DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù), 計算出1 g質(zhì)粒分子DNA的拷貝數(shù)為2.77×109。

圖2 pM12質(zhì)粒的PCR鑒定Fig. 2 PCR result of pM12M: DNA marker (DL1000); 1～2: 引物 M12-F/R;3～4: 引物sps-F/R; 5: 陰性對照。M: DNA marker (DL1000); 1-2: primer: M12-F/R;3-4: primer: sps-F/R; 5: negative control.

2.2 抗病轉(zhuǎn)基因水稻M12的定性PCR檢測

根據(jù)確定的外源基因插入位點旁鄰序列, 設(shè)計擴(kuò)增片段大小不同的引物對。經(jīng)過篩選, 得到特異性引物對M12-F/R。同時以M12質(zhì)粒分子和水稻品種M12、花優(yōu)14、華恢1號、旱優(yōu)3號和旱恢3T DNA為模板進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示, 只有M12質(zhì)粒分子和水稻M12擴(kuò)增得到258 bp條帶, 而其他品種和對照均沒有擴(kuò)增到目的條帶(圖 3), 說明這對引物特異性好, 可用于M12品系特異性定性PCR檢測。

利用M12-F/R引物, 使用10倍連續(xù)稀釋的M12質(zhì)粒DNA (10 000、1000、100、10、5拷貝)為模板進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增(圖4)。顯示,M12-F/R這對引物的PCR擴(kuò)增靈敏度較高, 100拷貝的M12質(zhì)粒DNA能夠擴(kuò)增到比較清晰、特異的258 bp條帶, 且隨著模板DNA濃度的增加, 擴(kuò)增條帶亮度增加。

圖3 M12事件特異性定性PCR的特異性檢測Fig. 3 Event-specific detection of qualitative PCR for M12:

圖4 M12事件特異性定性PCR的靈敏度分析Fig. 4 Sensitivity detection of qualitative PCR for M12 M12品系特異性擴(kuò)增(A)和水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因sps擴(kuò)增(B)。M: DNA marker (DL1000); 1～5: 10 000、1000、100、10、5 個拷貝單倍體水稻基因組; 6: 陰性對照。The qualitative PCR of event-specific M12 (A) and rice endogenous gene sps (B). M: DNA marker (DL1000); 1-5: 10 000, 1000, 100,10, 5 copies of haploid rice genomic DNA; 6: negative control.

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻M12的定量PCR檢測

2.3.1 定量PCR檢測體系的檢測極限和定量極限

在定量分析中, 檢測極限(limit of detection, LOD)和定量極限(limit of quantification, LOQ)指的是定量分析過程的最低檢測極限和最低有效定量極限, 即被檢測的樣品在 95%的精確度水平上能被檢測出和可被定量的最低含量或質(zhì)量。LOD和 LOQ是評價定量方法有效檢測范圍和準(zhǔn)確定量范圍的重要參數(shù),可通過低濃度樣品多次重復(fù)數(shù)值的再現(xiàn)性來確定。利用優(yōu)化好的 M12水稻事件特異性定量 PCR反應(yīng)體系, 分別以不同濃度的轉(zhuǎn)基因水稻M12質(zhì)粒分子10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、1000、100、10拷貝)為標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品測試建立的定量PCR方法的LOD和LOQ如表2所示, 根據(jù)9次重復(fù)試驗結(jié)果, M12基因定量PCR方法的LOD和LOQ分別是10和100拷貝單倍體水稻基因組, 說明本研究中檢測M12定量PCR方法具有高度的靈敏度。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 以梯度稀釋的 M12質(zhì)粒 DNA (10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、1000、100拷貝)為模板, 采用SYBR Green I染料法得到的M12和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因sps擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5和圖6)。M12事件特異性擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與起始模板線性方程為:Y= -3.441X+39.88, 相關(guān)系數(shù)R2=0.998; 擴(kuò)增效率為 95.3%;sps基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與起始模板量線性方程為:Y= -3.136X+33.356,相關(guān)系數(shù)R2=0.997, 擴(kuò)增效率為 108.4%, 所得參數(shù)可信度較高, 結(jié)果比較可信。

2.3.3 重復(fù)性分析 定量檢測體系的重復(fù)性(repeatability), 是指在不同時間段重復(fù)實驗之間的差異, 用標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示。本試驗的重復(fù)性通過對試驗體系的3次重復(fù)來計算(表3)。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子3次平行測定的Ct值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD), 結(jié)果如表3所示, SD變化范圍為0.043～0.276。說明本研究建立的定量檢測方法重復(fù)性較好, 結(jié)果比較可信。

表2 M12定量PCR檢測方法的檢測極限和定量極限分析Table 2 Limits of detection and quantification (LOD and LOQ) of M12 gene quantitative PCR

圖5 M12事件特異性擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Amplification plots and standard curves of M12質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)分別為10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、1000、100拷貝。10 000 000, 1 000 000, 100 000, 10 000, 1000, and 100 copies of plasmid DNA respectively

圖6 內(nèi)標(biāo)基因sps擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Amplification plots and standard curves of sps gene質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)分別為10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、1000、100拷貝。10 000 000, 1 000 000, 100 000, 10 000, 1000, and 100 copies of plasmid DNA, respectively.

表3 M12和sps基因定量PCR檢測體系的重復(fù)性分析Table 3 Repeatability of M12 and sps gene quantitative PCR assays

2.3.4 轉(zhuǎn)基因水稻 M12混合樣品定量檢測 利用建立的M12事件特異性定量PCR檢測方法, 使用sps基因做內(nèi)源參照基因, 分別對2個已知轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因水稻 M12樣品(轉(zhuǎn)基因成分含量分別為1.0%、0)定量分析, 總共100 ng DNA用于每個擴(kuò)增反應(yīng)。如表4所示, 2個混合樣品的真實值和檢測值檢測定量偏差在 8.0%, SD值為 0.04。說明建立的M12水稻品系特異性定量PCR檢測方法可實際用于轉(zhuǎn)基因M12樣品的定量檢測分析。

表4 轉(zhuǎn)基因水稻M12定量PCR檢測的混合樣品分析Table 4 Mixed sample analysis of M12 quantitative PCR assays

3 討論

歐盟于 1997年首先實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度,之后全球四十多個國家和地區(qū)相繼頒布了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度。我國于2015年10月1日正式開始執(zhí)行的《食品安全法》第六十九條就轉(zhuǎn)基因標(biāo)示問題明確提出: “生產(chǎn)經(jīng)營轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定顯著標(biāo)示”, 這表明我國對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重視, 也體現(xiàn)了對消費(fèi)者知情權(quán)的尊重。建立轉(zhuǎn)基因成分靈敏、準(zhǔn)確的定量標(biāo)識是實施轉(zhuǎn)基因安全標(biāo)識管理的一個關(guān)鍵步驟。目前, 針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的檢測, 國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中,主要應(yīng)用以 DNA為檢測對象的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù),特別是定性、定量 PCR檢測技術(shù)。定量 PCR檢測包括SYBR Green I染料法和TaqMan探針法等。染料法經(jīng)濟(jì)實惠, 不需要特別定制不同的特異性探針,通用性較好, 可以通過溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。本研究根據(jù)對 GC含量、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、Tm值、擴(kuò)增片段大小等參數(shù)分析, 研發(fā)了最佳的引物序列(M12-F/R), 但未發(fā)現(xiàn)最佳探針序列。本研究建立的基于SYBR Green I染料法的M12定性、定量PCR檢測方法, 均采用引物(M12-F/R), PCR擴(kuò)增序列橫跨水稻自身基因和外源基因, 在對含有多組分加工產(chǎn)品檢測時, 可以確定所檢出的基因片段來自 M12, 從而達(dá)到品種或品系鑒定的目的。在定性 PCR檢測方法中, 檢測的特異性較好, 靈敏度達(dá)到100拷貝單倍體水稻基因組; 在定量PCR檢測方法中, LOD和LOQ分別是10和100拷貝單倍體水稻基因組, 重復(fù)性較好, 可對混合樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測分析。

由于本試驗轉(zhuǎn)基因水稻M12質(zhì)量較少, 我們構(gòu)建了M12的質(zhì)粒分子。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要體現(xiàn)在可以通過微生物大量培養(yǎng), DNA易于純化, 質(zhì)量高,已開始作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測[15], 同時也被認(rèn)為是解決轉(zhuǎn)基因作物檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)嚴(yán)重缺乏的有效途徑之一[16-17]。本研究結(jié)果表明基于M12質(zhì)粒分子的定性、定量PCR方法, 最低檢測下限和定量下限均可達(dá)100拷貝DNA, 相當(dāng)于100 ng水稻基因組DNA中含有0.05%轉(zhuǎn)基因成分, 可滿足世界各國和地區(qū)標(biāo)識制度管理需要。因此, 本研究構(gòu)建的M12質(zhì)粒分子可用于相應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻M12及其衍生品種事件特異性定性、定量檢測。但是本研究建立的 M12質(zhì)粒分子和定性、定量 PCR檢測方法的適用性、穩(wěn)定性、定量的準(zhǔn)確性等都需要通過多個實驗室參與的協(xié)同試驗驗證, M12質(zhì)粒分子才可能被認(rèn)證為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 檢測方法才能得到更為廣泛和普遍的應(yīng)用, 進(jìn)而申報國家或農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn), 這也是我們接下來要做的工作。

4 結(jié)論

建立了抗病水稻M12及其加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分定性、定量檢測體系, 有助于相關(guān)行政主管部門加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因水稻及其產(chǎn)品的監(jiān)管, 為規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度提供有力的技術(shù)支持。

致謝: 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊立桃教授對試驗材料的研究背景及分析方法進(jìn)行指導(dǎo), 特此致謝。