吳顯熠　張中偉　吳小東　馮露　鄒茜婷　楊超

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院西藏駐成都辦事處分院重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610000；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610000)

高原紅細(xì)胞增多癥( high altitude polycythemia，HAPC ) 是一種高原低氧環(huán)境下所致的慢性疾病，主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞與血紅蛋白代償性增多，引起血液黏稠度增高，全血比黏度增高，進(jìn)而引起循環(huán)阻力增高，加重心臟負(fù)荷和組織缺氧，產(chǎn)生一系列癥狀和體征的臨床綜合征[1]。HAPC 的基本治療包括吸氧、 抗凝、血液稀釋等[2]。有研究表明，血液稀釋療法是降低紅細(xì)胞數(shù)量、控制血液粘滯度的有效手段[3]?；痉椒ㄊ禽斎脒m當(dāng)?shù)母鞣N稀釋液或放血，以期使血液濃度變稀，血細(xì)胞比容、胞粘稠度降低，從而改善增加局部血液流量，起到治療疾病的治療方法[4]。但HAPC患者放血療法的血液在臨床上常廢棄，未再利用。隨著我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展，臨床用血逐年上升，血液供應(yīng)日益緊張[5]。現(xiàn)獻(xiàn)血人群主要來(lái)自健康人群。若此類(lèi)患者可作為無(wú)償獻(xiàn)血者，一定程度上可達(dá)到治療目的，也可增加血液資源。

紅細(xì)胞在體內(nèi)主要功能是運(yùn)輸O2和CO2，而無(wú)氧酵解是紅細(xì)胞維持自身結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的能量來(lái)源。成熟紅細(xì)胞因沒(méi)有線粒體，幾乎完全依賴(lài)血漿中攝取葡萄糖，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，完成無(wú)氧酵解，產(chǎn)生ATP，其中LDH是無(wú)氧酵解中一種主要的催化酶。ATP是紅細(xì)胞能量代謝的重要產(chǎn)物，具有維持紅細(xì)胞膜ATP酶運(yùn)轉(zhuǎn)、啟動(dòng)糖酵解通路、維持紅細(xì)胞正常的雙凹形態(tài)以及紅細(xì)胞的血液流變學(xué)特性等多項(xiàng)功能[6]。本文通過(guò)采集不同Hb水平的高原人群組與平原正常人群組血液制成紅細(xì)胞懸液，在血液體外保存條件下對(duì)懸浮紅細(xì)胞無(wú)氧酵解能力相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析，初步探討其高原人群和平原人群體外保存懸浮紅細(xì)胞無(wú)氧酵解能力的不同，從代謝水平分析紅細(xì)胞功能差異。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑BC-5800 血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(深圳邁瑞);HITACHI全自動(dòng)生化分析儀(日本日立儀器有限公司);葡萄糖試劑盒(批號(hào)：20130405137，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);鄰聯(lián)甲苯胺(批號(hào)：20100609)， ATP檢測(cè)試劑盒。

1.2實(shí)驗(yàn)分組收集西藏自治區(qū)駐成都辦事處醫(yī)院2016年12月5日～2017年1月16日期間受檢的30例健康男性志愿者，年齡18～65歲。根據(jù)Hb水平和居住地區(qū)將志愿者分為A、B、C 3組，A組(高原紅細(xì)胞增多組)：世居高原(海拔≥3500m)，Hb≥180g/L；B組(高原正常人群組)：世居高原(海拔≥3500m)，Hb120～160g/L；C組(平原正常人群組)：世居平原地區(qū)(海拔<2500m)，Hb120～160g/L。

1.3懸浮紅細(xì)胞制備采集志愿者全血200ml，同時(shí)另外采集10ml全血作為待檢樣本立即進(jìn)行檢測(cè)。將全血標(biāo)本離心后去除大部分血漿，每份全血離心后加50ml MAP紅細(xì)胞保存液，制備得到懸浮紅細(xì)胞。再將每份懸浮紅細(xì)胞分裝到4個(gè)50ml轉(zhuǎn)移袋中，于-40℃冰箱保存，于第 1、7、21、35d分別取樣檢測(cè)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1血常規(guī)于采血當(dāng)天取全血及于保存第1、7、21、35d取懸浮紅細(xì)2ml用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、Hb濃度、HCT、紅細(xì)胞平均體積(MCV)。

1.4.2葡萄糖、LDH將懸浮紅細(xì)胞于3000g離心5 min取上清，然后用電解質(zhì)檢測(cè)儀直接檢測(cè)。

1.4.3ATP 分別在洗滌前/后取樣，每例10μl，加入裂解液1000μl，用微量移液器輕輕洗吸6次混勻，得到樣品裂解液(樣1)，用生理鹽水稀釋400倍(樣2)待測(cè)，全部操作在冰浴進(jìn)行，取ATP檢測(cè)試劑及ATP檢測(cè)試劑稀釋液，按1:9(V/V)混合，室溫放置3～5min，取100μl樣2加入96孔板，立即上機(jī)檢測(cè)。ATP檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司；編號(hào)：S0026)

2　結(jié)果

2.13組人群初始狀態(tài)外周全血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果A組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、Hb、HCT明顯高于C組(P<0.05)，而B(niǎo)、C兩組間則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

注：與C組比較，t分別為6.833、7.749、7.890，①P<0.05

2.23組人群ATP檢測(cè)結(jié)果A組與C組相比，僅在保存第7d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為A組的ATP含量低于C組；B、C兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，A組的ATP含量變化表現(xiàn)為先增高后降低(P<0.05)，B、C兩組的ATP含量變化差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.33組人群LDH檢測(cè)結(jié)果在整個(gè)保存過(guò)程中，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，LDH均逐漸增多(P<0.05)；A、B組與C組LDH相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.43組人群葡萄糖檢測(cè)結(jié)果與C組比較，A組僅在第21d時(shí)葡萄糖濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B、C兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，3組葡萄糖均逐步降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表2　3組人群ATP含量的變化情況Table 2　The change of ATP content in the 3 groups

注：與C組比較，t=-3.809,①P<0.05;與A組第1、7、21、35d比較，F(xiàn)=5.356,②均P<0.05

表3　3組人群LDH濃度變化情況Table 3　The change of LDH concentration in the 3 groups

表4　3組人群葡萄糖濃度的變化情況Table 4　The change of glucose concentration in the 3 groups

注：與C組比較,t為-2.443，①P<0.05；第1、7、21、35d比較, F分別為32.599、42.579、22.353，均P<0.05

3　討論

臨床應(yīng)用成分輸血始于20世紀(jì)60年代，到20世紀(jì)80年代末各發(fā)達(dá)國(guó)家成分輸血比例均在95%以上[7]。懸浮紅細(xì)胞作為成分血一個(gè)主要的血液組分，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)代醫(yī)療中, 臨床輸注全血或紅細(xì)胞的主要目的是增加患者循環(huán)血量, 提高血液攜氧能力[8]。但研究表明，血液在保存過(guò)程中, 紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變, 從而影響血液質(zhì)量和臨床輸血效果[9]。近期研究表明，在儲(chǔ)存過(guò)程中，對(duì)血液新陳代謝指標(biāo)更好的掌握，對(duì)于改善輸血策略非常重要，可能有助于臨床醫(yī)生在獲得對(duì)代謝的快速、有用的評(píng)估[10]。而無(wú)氧酵解相關(guān)指標(biāo)反應(yīng)的紅細(xì)胞能量代謝水平，可從一個(gè)方面分析紅細(xì)胞在體外保存中的質(zhì)量。

ATP是無(wú)氧酵解的能源物質(zhì)，是紅細(xì)胞內(nèi)多種生化反應(yīng)正常進(jìn)行所必須的。多項(xiàng)研究表明 ，ATP對(duì)于維持紅細(xì)胞膜鈉泵的運(yùn)轉(zhuǎn)，紅細(xì)胞內(nèi)鈣環(huán)境的恒定，膜脂質(zhì)的更新，紅細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，延長(zhǎng)紅細(xì)胞的保存期，以及提高輸注后紅細(xì)胞的存活率等均有舉足輕重的作用[11-13]，且當(dāng)紅細(xì)胞 ATP 的含量<1.5μmol/L時(shí)，輸血后24h紅細(xì)胞的存活率顯著下降[14]。在本研究中，高原紅細(xì)胞增多組人群ATP較既往研究[7,9,11,15]不同之處在于，呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，而平原、高原健康組內(nèi)人群均為逐漸下降。而高原紅細(xì)胞增多組較平原健康人群組僅在第7d時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

LDH是參與無(wú)氧酵解過(guò)程中催化乳酸和丙酮酸之間氧化還原反應(yīng)重要的酶類(lèi)，提示無(wú)氧酵解的潛力[16-17]。本研究結(jié)果顯示，高原紅細(xì)胞增多人群、高原健康人群較平原健康人群在血液保存期間LDH變化均一致，表現(xiàn)為隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示無(wú)氧酵解反應(yīng)均逐漸增強(qiáng)。

葡萄糖為無(wú)氧酵解的底物，是提供紅細(xì)胞能量的主要來(lái)源。隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，高原紅細(xì)胞增多組和平原健康人群組之間，僅在第21d時(shí)出現(xiàn)葡萄糖下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組人群葡萄糖濃度總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示紅細(xì)胞在離體過(guò)程中不斷消耗能量物質(zhì)，以維持自身結(jié)構(gòu)和功能。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高原不同Hb水平人群與平原正常人群的懸浮紅細(xì)胞體外保存，3組人群的紅細(xì)胞無(wú)氧酵解相關(guān)指標(biāo)無(wú)顯著性差異，大致符合既往研究[11-21]，反應(yīng)了不同HB人群紅細(xì)胞無(wú)氧代謝水平的一致性，為高原紅細(xì)胞增多癥患者作為獻(xiàn)血者提供一部分依據(jù)，但尚需更大樣本量體外研究及臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。