雷鳴任海龍

（1.西藏大學(xué)理學(xué)院；2.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

菊葉香藜是藜科刺藜屬植物［1］，其具有刺激性氣味，具有抑菌、昆蟲活力抑制等作用［2,3］，中藥用于治療哮喘、支氣管炎和偏頭痛［4］，據(jù)藏藥志記載有抗腫瘤活性［5］。菊葉香藜也為中等飼用植物［6］，通常情況下為亞優(yōu)勢(shì)種或伴生種［7］。研究發(fā)現(xiàn)在群落演替中重要值在明顯增加，同時(shí)也可作為固定沙地的指示植物［8］。許新勇等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在西藏“一江兩河”流域地區(qū)，伴隨著植被發(fā)育和群落演替的進(jìn)程，在半固定沙丘和固定沙丘，菊葉香藜逐漸成為優(yōu)勢(shì)種，說(shuō)明菊葉香藜本身生理生態(tài)特征非常適應(yīng)“一江兩河”流域氣候環(huán)境。2003年，朱格鱗等在Flora of China中，基于形態(tài)學(xué)特征將菊葉香藜等植物歸類到刺藜屬植物［1］，并未對(duì)菊葉香藜的進(jìn)行分子方面的鑒定。另外，psbA基因是葉綠體基因，序列相對(duì)保守，編碼產(chǎn)物D1蛋白，是PSⅡ反應(yīng)中心2個(gè)核心蛋白之一，介導(dǎo)光合作用過(guò)程中的電子傳遞［10］，在植物屬以上水平的分子系統(tǒng)發(fā)育的比較中具有顯著作用［11］。因此，在本研究中，通過(guò)菊葉香藜psbA序列生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建，為菊葉香藜的分類學(xué)提供分子依據(jù)。

1 方法

1.1 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)杖~香藜psbA基因全序列的獲取

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將注釋到psbA基因的unigenes在NCBI進(jìn)行比對(duì)，然后再進(jìn)行拼接。

1.2 菊葉香藜psbA基因編碼序列生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI在線分析軟件ORF Finder對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出可能的氨基酸序列；通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件PredictProtein，預(yù)測(cè)出氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)、相對(duì)親水表面、氨基酸組分和核苷酸組分；用CondonW和CUSP對(duì)菊葉香藜psba基因編碼序列進(jìn)行密碼子偏好性分析，基于中性繪圖和ENC-plot探索影響psba基因密碼子偏好性的因素；psba基因編碼蛋白的理化性質(zhì)采用ExPasy-ProtParam分析軟件及BioEdit軟件預(yù)測(cè)；疏水性/親水性采用Ex-Pasy-ProtScale預(yù)測(cè)；跨膜區(qū)域通過(guò)軟件TMHMM進(jìn)行分析；結(jié)構(gòu)功能域及功能分類采用ProtFun預(yù)測(cè)；通過(guò)Swiss-Model在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)BioEdit進(jìn)行序列差異分析；用MEGA6.05計(jì)算菊葉香藜與其近緣物種的遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菊葉香藜psbA基因系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其它物種psbA基因完整序列，共9個(gè)物種（表1）。

表1 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載9個(gè)物種psbA基因完整序列

2 結(jié)果

2.1 菊葉香藜psbA基因編碼序列生物信息學(xué)分析

2.1.1 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白理化性質(zhì)?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序，將注釋到psbA基因的unigenes（c1846_g1、c19645_g1、c24547_g1）在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，然后拼接在一起，最終的序列長(zhǎng)度為1059bp，GC含量為41%，序列已上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為：KY942083。

通過(guò)NCBI在線分析軟件ORF Finder對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出氨基酸序列，共353個(gè)氨基酸，如下所示：MTAILERRESESLWGRFCNWITSTENRLYIGWFGVL MIPTLLTATSVFIIAFIAAPPVDIDGIREPVSGSLLYGN NIISGAIIPTSAAIGLHFYPIWEAASVDEWLYNGGPYE LIVLHFLLGVACYMGREWELSFRLGMRPWIAVAYSA PVAAATAVFLIYPIGQGSFSDGMPLGISGTFNFMIVFQ AEHNILMHPFHMLGVAGVFGGSLFSAMHGSLVTSSLI RETTENESANEGYRFGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQ YASFNNSRSLHFFLAAWPVVGIWFTALGISTMAFNLN GFNFNQSVVDSQGRVINTWADIINRANLGMEVMHER NAHNFPLDLAAIEAPSING

負(fù)電荷殘基總數(shù)為28，正電荷殘基總數(shù)為15,其理論分子量為38962.62Da，理論等電點(diǎn)為5.12，不穩(wěn)定指數(shù)是36.33。分子式為C1793H2682N456O493S14，原子總數(shù)為5438，脂肪系數(shù)為96.77。

2.1.2 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白氨基酸組分分析。氨基酸組分中最多的為A 35(9.9%)，最少的為C 2（0.6%），其中，沒(méi)有氨基酸K；相對(duì)親水表面為71.67%在0-16%之間，28.33%在16%-100%之間。（如圖1所示）

圖1 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白氨基酸組分

2.1.3 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件PredictProtein，預(yù)測(cè)出氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋57.51%，β-折疊4.82%，β-轉(zhuǎn)角37.68%.

2.1.4 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白親疏水性分析。用ProtParam分析軟件對(duì)菊葉香藜psbA基因編碼蛋白的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，其疏水性平均系數(shù)為0.350。參照ExpASy的Protscale程序計(jì)算菊葉香藜psbA基因編碼蛋白的疏水性/親水性圖譜（圖2）分析氨基酸殘基的得分可知，多肽鏈的第51號(hào)的丙氨酸(Ala)具有最高分值3.189，疏水性最強(qiáng)。第234號(hào)天冬酰胺(Asn)具有最低分值-2.133，親水性最強(qiáng)。

圖2 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白親疏水性分析

2.1.5 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白跨膜區(qū)域。由圖3可知，菊葉香藜psbA基因編碼蛋白存在7個(gè)跨膜區(qū)域，分別位于29～51、71～93、105～127、142～164、171～193、197～219和273～295氨基酸之間，跨膜區(qū)分析結(jié)果與該蛋白的親/疏水性分析結(jié)果基本一致。

圖3 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白跨膜區(qū)域

2.1.6 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)功能域及功能分類。通過(guò)Protfun分析軟件預(yù)測(cè)菊葉香藜psbA基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)功能域及功能分類從分析結(jié)果可知（表2），菊葉香藜psbA基因編碼蛋白為非酶類(Prob=0.805，odds=1.128)和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(Prob=0.191,odds=1.749)，該蛋白具有翻譯、脂肪酸代謝、輔酶因子的生物合成和能量代謝作用的可能性分別為4.760、4.477、3.423和2.195。因此，推測(cè)該蛋白的主要作用與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

表2 psbA基因編碼的蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)

2.1.7 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)Swiss-Model在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出三級(jí)結(jié)構(gòu)，選取Template＞30%、GQME值接近1、|QMEAN|＜4的模型，預(yù)測(cè)出的菊葉香藜psbA基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖4 菊葉香藜psbA基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

2.1.8 菊葉香藜psbA基因密碼子偏好性。通過(guò)CUSP和CondoW程序分析菊葉香藜及其近緣種psbA基因的密碼子偏好性基本指標(biāo)。從表3中可以看出，各物種psbA基因在密碼子偏好性方面差異較小，其中CBI、GC含量、GC3和GC3s，莧科植物均大于藜科植物，而ENC值，莧科植物均小于藜科植物。GC1、GC2、GC3和GC含量均小于0.5，說(shuō)明psbA基因密碼子各位點(diǎn)均偏好使用含A/T的密碼子，而GC3s均小于0.3，說(shuō)明在同義密碼子中，psbA編碼序列更偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子,其中，NNT＞NNA＞NNC＞NNG,NNT遠(yuǎn)大于NNC。ENC值均位于35-50之間，說(shuō)明psbA基因密碼子偏好性一般，基因表達(dá)水平一般。

通過(guò)CUSP和CondoW程序分析菊葉香藜psbA基因的密碼子偏好性可知，菊葉香藜psbA基因總共使用了49個(gè)密碼子，23個(gè)密碼子為偏好性密碼子(RSCU＞1)，其中 GCU、GAU、GAA、GGU、AUU、CUA、UUA、CCU、CAA、CGU、AGU、UCU、ACU和GUA為高頻密碼子（RSCU＞1.5），以GU和CU結(jié)尾的密碼子全部為高頻密碼子。在偏好性密碼子中，有18個(gè)密碼子以A/T結(jié)尾，這18個(gè)密碼子Fraction和使用頻率(Frequency)都相對(duì)較高（表4）。

為探索影響psbA基因密碼子偏好性的因素，通過(guò)中性繪圖和ENC-plot繪圖進(jìn)行分析。中性繪圖結(jié)果顯示(圖5所示)，GC12與GC3相關(guān)性不顯著（R2=0.1，P=0.251），說(shuō)明psbA基因密碼子第1、2位和第3位堿基相關(guān)性不顯著，psbA基因GC含量高度保守，密碼子偏好性主要受選擇作用影響。

ENC繪圖結(jié)果顯示（圖6），所有物種的psbA基因均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方相對(duì)較遠(yuǎn)的位置，說(shuō)明密碼子的偏好性只受到選擇作用的影響。進(jìn)一步探究影響選擇作用的因素，本研究主要分析CAI值和蛋白長(zhǎng)度對(duì)ENC值的影響，發(fā)現(xiàn)CAI值與ENC值表現(xiàn)為極顯著的負(fù)相關(guān)（R2=0.6817，P＜0.01，回歸方程為：y=-37.053x+51.522），蛋白長(zhǎng)度與ENC值表現(xiàn)為完全線性相關(guān)（x=353）。因此，選擇作用主要受到表達(dá)水平和蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的影響，psbA基因密碼子偏好性受到表達(dá)水平和蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的的影響。

表3 菊葉香藜及其近緣種psbA基因的密碼子偏好性基本指標(biāo)

表4 CUSP和CondoW程序分析菊葉香藜psbA基因的密碼子偏好性

圖5 GC3和GC12中性繪圖結(jié)果

圖6 GC3s和ENC繪圖結(jié)果

2.1.9 菊葉香藜psbA基因系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果。由菊葉香藜及其近緣物種的psba完整序列生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知（圖7），系統(tǒng)樹上聚為兩大支，藜科和莧科各聚為一大支，說(shuō)明在藜科和莧科中，psbA基因存在差異。而對(duì)于藜科這一支來(lái)說(shuō)，psbA基因在藜科各屬之間差異相對(duì)較大；各進(jìn)化支部分種間自展值為100%，說(shuō)明psbA序列對(duì)于種的鑒定存在一定的局限性。菊葉香藜原為藜科藜屬植物，但在近年來(lái)的藜屬與刺藜屬的爭(zhēng)議中，被劃為藜科刺藜屬中，從圖7中我們可知，菊葉香藜與藜屬植物分別聚為一支，正好與形態(tài)學(xué)分類上的觀點(diǎn)一致。

圖7 菊葉香藜psbA基因系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果（“●”為菊葉香藜）

3 討論

菊葉香藜psbA基因編碼序列長(zhǎng)度為1059bp，GC含量為41%，共編碼353個(gè)氨基酸，最多的為丙氨酸(A)，為35個(gè)(9.9%)，不含有賴氨酸，符合psbA基因的特征。二級(jí)結(jié)構(gòu)包含α-螺旋(57.51%)，β-折疊(4.82%)，β-轉(zhuǎn)角(37.68%)。psbA 基因編碼蛋白為疏水性蛋白，包含7個(gè)跨膜區(qū)域，是非酶類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。psbA基因密碼子偏好性水平相對(duì)較弱，主要受到選擇作用、表達(dá)水平和蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的影響，該結(jié)果與尚明照等［12］研究結(jié)果一致，為進(jìn)一步研究影響psbA基因密碼子偏好性的因素提供依據(jù)。在同義密碼子中，psbA編碼序列更偏好使用以 A/T 結(jié)尾的密碼子,其中，NNT＞NNA＞NNC＞NNG,NNT遠(yuǎn)大于NNC，與侯惠靜［13］研究結(jié)果不一致，與侯士昌等［14］研究結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果證明菊葉香藜與藜屬植物存在差異，支持將其劃歸到刺藜屬中。