孔　晶，杜藝玫，周若雨，馬菲菲，何芋岐，周旭美

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 國(guó)家級(jí)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

膽汁酸具有促進(jìn)脂溶性維生素、脂類在哺乳動(dòng)物體內(nèi)消化吸收，調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用，同時(shí)也是大多數(shù)藥物在肝臟代謝中主要的生理調(diào)節(jié)劑。其作為肝臟法尼醇 X 受體(FXR)的天然配體，可通過激活FXR受體及膜G蛋白偶聯(lián)受體功能，起到調(diào)節(jié)肝臟代謝的信號(hào)分子作用[1]。據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，長(zhǎng)期高脂飲食可損傷腸道黏膜的屏障功能[2-3]，增加總膽汁酸和脫氧膽汁酸含量[4]，觸發(fā)炎癥性腸道疾病微生物的生長(zhǎng)，影響FXR受體調(diào)節(jié)膽汁酸代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和配置[5-6]。因此，膽汁酸代謝調(diào)控通路對(duì)于機(jī)體調(diào)控血糖、膽固醇及腸道微生物起到十分重要的作用[7]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道較多的為單個(gè)基因在膽汁酸代謝調(diào)控通路中的調(diào)控作用[8-9]，而高脂飲食壓力對(duì)該通路的影響尚未見系統(tǒng)性研究報(bào)道。本研究通過制備高脂模型小鼠，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，系統(tǒng)性了解在高脂飲食壓力下對(duì)小鼠肝臟膽汁酸代謝調(diào)控通路關(guān)鍵基因的影響，為藥物研發(fā)作用基因靶點(diǎn)及臨床精準(zhǔn)用藥提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004)。選取日齡約42～56 d，體重約23～25 g 共22只，以體重為條件隨機(jī)分為對(duì)照組[飼喂普通飼料，成分組成：脂肪12.1%；碳水化合物64.7%；蛋白質(zhì)23.2%，江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，蘇飼證(2014)01008]及模型組(飼喂高脂飼料，成分組成：脂肪60%；碳水化合物20%；蛋白質(zhì)20%，美國(guó)Research Diets公司)各11只。兩組均在屏障環(huán)境下飼喂16周，自由飲水、進(jìn)食，每日2次，晝夜均衡。

1.2血清學(xué)標(biāo)本采集及測(cè)定至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，小鼠處死前進(jìn)行水合氯醛麻醉，摘眼球取血，于室溫靜置約1 h后，以3 500 rpm離心10 min，吸取分離上清液用于測(cè)定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)及高密度脂蛋白(HDL-C)水平。采用MULTISKAN GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)及南京建成生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3肝臟膽汁酸分析稱取100 mg肝臟組織，加入乙腈300 μL勻漿，于4 ℃，14 300 rpm離心10 min，取250 μL氮吹儀吹干，用100 μL50%甲醇復(fù)溶殘?jiān)?，待充分溶解后相同參?shù)再次離心，取上清進(jìn)行LC-MS分析。采用Agilent 6420三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Agilent科技有限公司)，固定相 CQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)，流動(dòng)相為乙腈和乙酸銨，參考文獻(xiàn)報(bào)道參數(shù)進(jìn)行梯度洗脫[10]。質(zhì)譜參數(shù)：Gas Temp：326 ℃，Gas Flow：12 L/min，Nebulizer：55 psi，Capillary：3 500 V。質(zhì)量分析器參數(shù)為負(fù)離子模式下離子檢測(cè)。

1.4總RNA提取及測(cè)序選取具有典型變化的對(duì)照組及模型組各5個(gè)肝臟組織樣本，分別稱取20 mg加入TRlzol溶液1 mL，置冰上勻漿，勻漿液加入200 μL氯仿，上下顛倒混合均勻后，室溫孵育10 min，在12 000 rpm 4 ℃下離心15 min，分離上清液與500 μL異丙醇充分混勻，相同參數(shù)下再次離心15 min，棄去上清液。加入1 000 μL 75%乙醇(DEPC水配制)，用移液器反復(fù)吸打乙醇，洗滌RNA沉淀，4 ℃，7 500 rpm 離心15 min后棄上清液，用微型離心機(jī)將管內(nèi)壁上的乙醇甩至管底，用10 μL槍頭吸出后常溫放置沉淀，待揮干后加入20 μL DEPC水重懸RNA。采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。送華大基因公司(BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái))進(jìn)行測(cè)序。

1.5數(shù)據(jù)處理采用熱圖可視化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄變化進(jìn)行宏觀表達(dá)，經(jīng)R語言中g(shù)plots工具包的heatmap.2函數(shù)完成。采用主成分分析法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以小鼠個(gè)體為樣本，單個(gè)樣本的每一個(gè)基因表達(dá)值作為變量構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)R語言開源工具包中mixOmics對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行 PCA函數(shù)處理。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件，組間比較使用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1小鼠體重變化經(jīng)過16周的高脂飼料飼喂，對(duì)照組小鼠體重增漲8.35%，模型組小鼠體重增漲30.60%。表1表明，經(jīng)16周高脂飲食飼養(yǎng)明顯增加小鼠體重(P<0.01)。

組別0周16周對(duì)照28.85±1.9131.26±2.03模型29.00±1.9341.78±2.28?

與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2血脂水平變化兩組小鼠分別給予普通飼料及高脂飼料連續(xù)飼喂16周后，取血清測(cè)定TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，可見與對(duì)照組相比，模型組小鼠TC(P<0.01)、LDL-C(P<0.05)水平增高(見表2)，TG、HDL-C無明顯變化。

組別TCTGLDL-CHDL-C對(duì)照3.27±0.460.72±0.140.20±0.120.98±0.61模型4.97±1.73?0.67±0.330.66±0.38#1.14±0.50

與對(duì)照組比較，*P<0.01，#P<0.05。

2.3膽汁酸分析結(jié)果比較本研究采用LC-MS檢測(cè)膽酸(CA)和鵝脫氧膽酸(CDCA)含量，經(jīng)高脂飲食連續(xù)飼喂16周后，模型組CA和CDCA下降(P<0.05，見表3)。

組別CACDCA對(duì)照(6.76±0.60)×106(0.91±0.30)×106模型(0.12±0.02)×106#(0.14±0.03)×106#

與對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.4基因表達(dá)差異及顯著性分析

2.4.1輪廓可視化結(jié)果選用無監(jiān)督聚類分析及可視化得圖1，直觀地展現(xiàn)了對(duì)照組與模型組基因表達(dá)上的差異，從宏觀上體現(xiàn)了高脂飲食造成了小鼠肝臟基因轉(zhuǎn)錄的顯著變化，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，黑色表示不變。

2.4.2火山圖結(jié)果火山圖可以展示具有顯著差異表達(dá)基因的整體輪廓，以倍數(shù)變化(Fold Change)≥2.0作為差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，縱坐標(biāo)值越大，表示P值越小，越有顯著性。從火山圖結(jié)果看，差異基因在不同區(qū)間得到分布。為更進(jìn)一步的明確膽汁酸代謝調(diào)控通路基因表達(dá)水平的變化，以小鼠個(gè)體為樣本，單個(gè)樣本的每一個(gè)基因表達(dá)值作為變量構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，對(duì)其進(jìn)行主成分分析(見圖2)。在選取2個(gè)主成分的情況下，得分圖(見圖3A)中能夠顯著區(qū)分兩組小鼠，結(jié)合載荷圖(見圖3B)信息發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食壓力下變化最為顯著的基因是Cyp3a11和Scp2。

圖1　膽汁酸通路中43個(gè)主要直接基因在高脂飲食壓力下的輪廓可視化

圖2　高脂飲食壓力下膽汁酸通路基因表達(dá)火山圖

2.4.3基因表達(dá)的量化結(jié)果為了量化上述7個(gè)基因差異表達(dá)倍數(shù)值，將模型組差異基因平均表達(dá)值與對(duì)照組平均表達(dá)值相比得圖4柱形圖，縱坐標(biāo)表示平均上下調(diào)倍數(shù)。從圖4可知，Cyp3a11、Nr0b2、Hnf4aos和Fgfr4基因表達(dá)下調(diào)，Cyp39a1、Scp2、Hsd17b4基因表達(dá)上調(diào)，P均<0.05。

A：主成分分析得分圖；B：主成分分析載荷圖。圖3　高脂飲食壓力下膽汁酸輪廓主成分分析

圖4　高脂飲食對(duì)Cyp3a11、Nr0b2、Hnf4aos、Fgfr4、Hsd17b4、CYp39a1、Scp2基因表達(dá)的調(diào)控

3　討論

本研究顯示，高脂飼料飼喂16周后，模型組小鼠TC、LDL-C水平顯著增高(P<0.01，P<0.05)，符合高脂模型血清學(xué)指標(biāo)改變。CA和CDCA作為正常膽汁中的初級(jí)膽汁酸成分，本實(shí)驗(yàn)中CA和CDCA顯著下降(P<0.05)。Watanabe等[9]研究表明，CA可促進(jìn)能量消耗達(dá)到降低高脂飲食小鼠體重的作用。而CDCA具有利膽、溶石的作用，已將其作為治療膽固醇結(jié)石藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。說明在長(zhǎng)期高脂飲食壓力下，將增加患膽固醇結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)。

膽汁酸在體內(nèi)的調(diào)控主要經(jīng)肝臟和腸道得以實(shí)現(xiàn)，其合成主要有兩條途徑，經(jīng)典途徑是膽汁酸合成的主要途徑，由膽固醇-7α-羥化酶(Cyp7a1)限速酶催化；替代途徑，由甾醇27α-羥化酶(Cyp27a1)催化。早已論證，Cyp7a1在轉(zhuǎn)錄水平受到膽汁酸的反饋調(diào)節(jié)，在此過程中盡管FXR沒有直接與Cyp7a1的啟動(dòng)子相結(jié)合，但卻能夠誘導(dǎo)小分子異源二聚體伴侶(SHP)的表達(dá)，目前認(rèn)為，F(xiàn)XR與SHP是膽汁酸，脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。而Nr0b2作為SHP的啟動(dòng)子，亦間接參與膽汁酸通路的調(diào)節(jié)。膽汁酸的腸道調(diào)控，是通過激活腸道FXR核受體，上調(diào)腸道多肽成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15(Fgf15)，F(xiàn)gf15經(jīng)腸肝循環(huán)到達(dá)肝臟后與受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4(Fgfr4)結(jié)合，上調(diào)應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的活性[11]。JNK和ERK可通過磷酸化作用抑制Cyp7a1的表達(dá)[12]。Cyp3a11是膽汁酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化過程中重要的酶，參與催化膽汁酸的羥基化反應(yīng)，主要代謝產(chǎn)物為3-酮膽酸和多氧膽酸[13]。據(jù)Wahlstr?m等[14]的研究報(bào)道，使用UPLC-MS / MS分析來自Cyp3a敲除小鼠的肝臟、膽囊、盲腸和血清中的膽汁酸組成與野生型littermate對(duì)照，顯示膽汁酸組成沒有顯著差異。是否其中還有其他補(bǔ)償機(jī)制的存在，將在今后的研究中進(jìn)一步挖掘。本研究中，Cyp3a11、Nr0b2、Fgfr4基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。

此外，本研究結(jié)果中，Cyp39a1、Scp2及Hsd17b4在高脂飲食壓力下呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)。Smelt指出[15]，Cyp39a1亦參與了膽汁酸合成的替代途徑，最終生成鵝去氧膽酸。由于替代途徑僅約占全部膽汁酸合成量的8.7%[16]，所以固然Cyp39a1表達(dá)升高，在最終的含量測(cè)定結(jié)果中CDCA仍表現(xiàn)為降低。Scp2主要參與胞內(nèi)膽固醇的合成與轉(zhuǎn)化，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，當(dāng)Scp2高表達(dá)時(shí)，一方面增加膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，提高3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的活性，使肝臟膽固醇合成增加，膽固醇在膽汁中濃度上升；另一方面，其抑制Cyp7a1酶活性使膽汁酸合成減少，膽固醇排泄降低。反之，抑制Scp2表達(dá)，可有效降低膽固醇濃度[18]，這也為調(diào)脂藥物作用靶點(diǎn)提供新的視角。Hsd17b4，為類固醇代謝過程中重要的酶蛋白，目前較多實(shí)驗(yàn)研究表明[19]，肝癌的發(fā)生及發(fā)展與雌二醇相關(guān)，雌二醇可有效減緩肝癌的病理過程，但Hsd17b4可將其滅活成為低活性的雌酮而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，在肝癌組織中Hsd17b4具有高表達(dá)。長(zhǎng)期高脂飲食是否會(huì)增加肝臟癌癥的患病率，還有待進(jìn)一步深入的研究。