李 寧，程 迪，高 峰，馬 強(qiáng)，張建平，董筱萍，劉英姿*

（1.遼寧省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心，遼寧 沈陽 110001；2.大連晶泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，遼寧 大連 116000；3.遼寧省北鎮(zhèn)市動(dòng)物檢疫站，遼寧 北鎮(zhèn) 121300；4.遼寧省錦州市義縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 義縣 121101；5.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

奶牛乳房炎主要是由病原微生物引起的乳房實(shí)質(zhì)和間質(zhì)的炎癥。該病自發(fā)現(xiàn)已有150多年的歷史，至今仍是奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)病率高、經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的疾病之一[1]?；疾∧膛Ｈ榉坎课怀霈F(xiàn)不同程度的組織病變，產(chǎn)奶數(shù)量和質(zhì)量均有所降低，奶牛的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到嚴(yán)重影響。該病病因復(fù)雜，生物因素是主要原因，且病原微生物種類較多，多項(xiàng)研究證實(shí)葡萄球菌，大腸桿菌，鏈球菌幾種病原菌混合感染的情況逐漸增多[2-3]。多年來，抗生素仍是臨床上首選的治療方法，但不規(guī)范使用和過度依賴抗生素的情況導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、奶中藥物殘留、奶牛自身的二重感染等問題逐漸增多[4]。本文針對遼西地區(qū)幾個(gè)牛場中臨床型奶牛乳房炎病例進(jìn)行病原菌分離鑒定，并使用臨床上常見的抗生素對優(yōu)勢菌株進(jìn)行耐藥性分析，旨在查明遼西地區(qū)臨床型奶牛乳房炎的主要優(yōu)勢病原菌及其對常用抗生素的藥物敏感性，為該地區(qū)針對奶牛乳房炎進(jìn)行科學(xué)防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 腦心浸出液培養(yǎng)基、KF鏈球菌營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物有限技術(shù)公司；麥康凱營養(yǎng)瓊脂、伊紅美蘭瓊脂營養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑革蘭氏染色液、生物梅里埃藥敏試劑盒購自bio Merieux，sa；PCR Master Mix緩沖液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 2000 Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 樣品采集在遼西5個(gè)市中，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)選取規(guī)?；膛?～2個(gè)，依據(jù)農(nóng)業(yè)部《奶牛乳房炎防治技術(shù)指南（試行）》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2010]29號(hào)）的規(guī)定作為奶牛乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇患有臨床型奶牛乳房炎并處于泌乳期的病牛作為樣本對象。采集前先用溫水清洗乳房，隨后使用75%酒精進(jìn)行消毒，棄去前兩把乳汁。取適量乳汁放入15 mL滅菌離心管中，標(biāo)記牛號(hào)和日期，放入冰盒，送回實(shí)驗(yàn)室。將奶樣12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，取沉淀加入適量腦心浸出液液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。

1.3 傳統(tǒng)方法分離鑒定病原菌用一次性接種棒挑取適量培養(yǎng)后的菌液劃線于哥倫比亞血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。取出現(xiàn)溶血環(huán)的菌落劃線于KF鏈球菌營養(yǎng)瓊脂和腦心浸出液固體培養(yǎng)基，并進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢觀察。在KF鏈球菌營養(yǎng)瓊脂上生長良好且鏡檢結(jié)果為革蘭陽性球菌，繼續(xù)用KF鏈球菌營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)；對于在KF鏈球菌營養(yǎng)瓊脂上不生長的菌落，則使用腦心浸出液固體培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)；對于出現(xiàn)金黃色或黃色色素的菌落，則選擇高鹽甘露醇培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)；對于菌落較大、邊緣不整齊且48 h后產(chǎn)生異味的菌落，劃線于麥康凱培養(yǎng)基并鏡檢觀察，反復(fù)純化直至菌落純凈單一。其余形態(tài)和大小不同的菌落，均劃線于BHI固體培養(yǎng)基，反復(fù)鏡檢純化。50%甘油溶液1:1比例稀釋菌液，-80℃保存菌株。

1.4 16SrRNA基因分析法鑒定細(xì)菌

1.4.1 提取細(xì)菌基因組從菌株凍存液中移取10 μL至5 mL BHI液體培養(yǎng)基，24 h過夜培養(yǎng)，復(fù)蘇菌種。將復(fù)蘇好的菌種按照《細(xì)菌基因組提取試劑盒》說明及步驟提取分離細(xì)菌基因組。

1.4.2 PCR擴(kuò)增利用細(xì)菌16S rRNA基因序列中保守區(qū)設(shè)計(jì)引物如下：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR擴(kuò)增體系為30 μL：2×PCR Mix 15 μL， DNA 模 板 1 μL，10 mol/L 27F引物0.5 μL，10 mol/L 1492R引物 0.5 μL，ddH2O 13 μL。采用 Biometra Personal Cycler PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。4℃保存。

1.5 藥敏試驗(yàn)使用生物梅里埃葡萄球菌藥敏試劑盒ATB STAPH 5測試分離到的34株金黃色葡萄球菌對常用抗生素的耐藥性；使用生物梅里埃腸道細(xì)菌藥敏試驗(yàn)試劑盒ATB G-5測試分離的25株大腸桿菌耐藥性；使用生物梅里埃腸球菌藥敏試劑盒ATB Enteroc 5測試分離到的17株無乳鏈球菌耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)方法分離鑒定主要細(xì)菌從89份臨床型奶牛乳房炎奶樣中共分離培養(yǎng)出13種細(xì)菌共103株。種類如下：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎克雷伯氏桿菌、芽孢桿菌、糞腸球菌、乳酸球菌、志賀桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、牛棒狀桿菌等細(xì)菌。其中金黃色葡萄球菌34株，占33%；大腸桿菌25株，占24.3%；無乳鏈球菌10株，占9.7%。多數(shù)呈單一細(xì)菌感染，少部分樣品呈混合細(xì)菌感染，多為金黃色葡萄與凝固酶陰性葡萄球菌混合感染。

2.216 SrRNA基因分析法鑒定細(xì)菌按上述PCR體系條件擴(kuò)增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得長度為1 500 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，詳見圖1。

圖1 代表分離株16s rRNA序列測序結(jié)果Fig.1Sequencing result on separator 16s rRNA sequence

2.3 主要細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果遼西奶牛乳房炎無乳鏈球菌藥敏結(jié)果見表1，該菌株對氨芐西林、萬古霉素、利福平、替考拉寧敏感性高，為100%；四環(huán)素、鏈霉素次之，分別為70%和60%；對青霉素、環(huán)丙沙星耐藥率較高，超過70%。遼西奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果見表2，該菌株敏感率較高的藥物有米諾環(huán)素、呋喃妥因、喹奴普汀、克林霉素；耐藥率較高的藥物有青霉素、苯唑西林、萬古霉素、紅霉素。遼西乳房炎大腸桿菌藥敏結(jié)果見表3，該菌株敏感率較高的藥物有頭孢西丁、替卡西林；耐藥率較高的藥物依次為阿莫西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明。

表1 無乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1Results of without Streptococcus Lactococcus drug sensitivity test %

表2 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of Staphylococcus aureus drug sensitivity test %

表3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3Results of E.coli drug sensitivity test %

3 討論

3.1 本試驗(yàn)通過分離鑒定遼西地區(qū)臨床型奶牛乳房炎的病原菌，結(jié)果顯示該地區(qū)主要奶牛乳房炎病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌。其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染占多數(shù)，是該地區(qū)奶牛乳房炎主要的病原菌；該地區(qū)分離到的鏈球菌均為單一的無乳鏈球菌，與其他地區(qū)報(bào)道的奶牛乳房炎鏈球菌為多種類型不同。

3.2 通過形態(tài)學(xué)觀察和遺傳學(xué)分析兩個(gè)方法鑒定病原菌，兩個(gè)方法的結(jié)果一致，傳統(tǒng)鑒定細(xì)菌常結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生化分析，但生化分析受試劑和試驗(yàn)條件影響較大，存在結(jié)果不穩(wěn)定的情況；而利用細(xì)菌的保守區(qū)域16s rRNA通過基因分析來鑒定細(xì)菌種屬的方法已開始普遍應(yīng)用，結(jié)果可靠且能夠分析細(xì)菌遺傳進(jìn)化距離和關(guān)系[5]，可以進(jìn)一步判斷細(xì)菌傳染來源和變異情況，為疫病防制提供更加詳細(xì)的生物信息和可靠依據(jù)。

3.3 使用生物梅里埃藥敏試劑盒對遼西地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌對青霉素產(chǎn)生了高耐藥性，而金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對環(huán)丙沙星也同時(shí)產(chǎn)生了顯著的耐藥性；無乳鏈球菌對萬古霉素高度敏感，但金黃色葡萄球菌對萬古霉素卻產(chǎn)生了高耐藥性，同時(shí)金黃色葡萄球菌對紅霉素、苯唑西林，大腸桿菌對阿莫西林、頭孢噻吩、復(fù)方新諾明產(chǎn)生了耐藥性。這與養(yǎng)殖場長期使用抗生素治療奶牛乳房炎的現(xiàn)象有關(guān)，尤其是遼西地區(qū)的分離株對青霉素全部耐藥，這與國內(nèi)外的其他的報(bào)道結(jié)果相符。依據(jù)上述結(jié)果，青霉素和環(huán)丙沙星應(yīng)該作為臨床治療奶牛乳房炎的淘汰藥物[6-7]。

3.4 針對奶牛乳房炎病原微生物復(fù)雜，不同牛場分離菌存在差異，所以調(diào)查本地區(qū)奶牛乳房炎病原菌種類，篩選主要的流行菌株，明確菌株的耐藥性，在治療時(shí)有針對性地選擇藥物及交叉用藥，適當(dāng)結(jié)合中藥，以達(dá)到最佳的治療效果。此外，奶牛乳房炎的發(fā)病與飼養(yǎng)管理密切相關(guān)，防制奶牛乳房炎需遵循防大于治的原則，把控飼養(yǎng)管理等環(huán)境因素，采取綜合防治措施，以達(dá)到有效預(yù)防。