陳虹,徐東升,楊金生,白萬柱,閆平慧,王瑩瑩

?

艾灸對陽陵泉穴區(qū)皮膚組織五羥色胺和組胺的影響

陳虹1,徐東升2,楊金生2,白萬柱2,閆平慧1,王瑩瑩2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽 712046;2.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所,北京 100700)

運用免疫組化結(jié)合共聚焦技術(shù)揭示艾灸對陽陵泉穴區(qū)皮膚組織五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)的影響。以大鼠為實驗對象,剃除雙后肢陽陵泉穴區(qū)毛發(fā),充分暴露皮膚組織,對左側(cè)陽陵泉穴進行艾灸治療,灸后即刻灌流,并分別取兩側(cè)穴區(qū)皮膚組織(1 cm×1.5 cm),經(jīng)25%高滲糖脫水后用冰凍切片機制成20mm系列組織切片,然后分別用5-HT及HA抗體進行熒光免疫組化檢測。艾灸后皮膚組織中5-HT和HA陽性表達明顯增強,5-HT分別在表皮層與真皮層之間,皮下組織層沿血管形成連續(xù)的增強帶;HA主要集中分布在真皮層深部及皮下組織的血管旁。通過顯微鏡計數(shù),艾灸后皮膚組織中5-HT和HA陽性標記數(shù)量明顯高于正常皮膚組織,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。艾灸能夠使陽陵泉穴區(qū)皮膚組織中5-HT和HA的表達上調(diào),其可能參與艾灸作用通路的信息傳遞。

灸法;五羥色胺;組胺;穴,陽陵泉

艾灸是通過溫?zé)岽碳ぜ八幬镒饔弥委熂膊〉闹嗅t(yī)傳統(tǒng)外治法[1]。在我國古代,熱灸療法早于針刺療法[2],至今仍廣泛應(yīng)用于臨床治療。以往研究從熱灸刺激信號的傳導(dǎo)通路入手,認為艾灸的作用機制為熱灸刺激產(chǎn)生的物理和化學(xué)因子作用于腧穴感受裝置,通過外周傳入途徑,刺激信號傳入中樞,經(jīng)過信號整合傳出,從而起到調(diào)控作用[3-4]。然而這些研究基本是在宏觀和大解剖學(xué)水平上進行的,而對于艾灸過程中的活性物質(zhì)參與及其級聯(lián)反應(yīng)的研究,目前鮮有報道。

近年來,隨著體表醫(yī)學(xué)研究的深入,體表刺激的直接作用部位穴區(qū)成為研究熱點,現(xiàn)已對穴區(qū)皮膚組織血管和神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)特征進行了相關(guān)研究[5],并發(fā)現(xiàn)正常穴區(qū)局部存在組織細胞化學(xué)動態(tài)變化[6],這為我們更深入了解穴區(qū)局部組織結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的構(gòu)成提供了新的視角。為了進一步了解艾灸對穴區(qū)活性物質(zhì)動態(tài)變化的影響,本實驗擬以健康SD大鼠為研究對象,運用免疫組化結(jié)合激光共聚焦技術(shù),觀察和比較穴區(qū)正常皮膚組織和艾灸皮膚組織中活性物質(zhì)五羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)和組胺(histamine, HA)的變化,以探索艾灸作用信息的傳導(dǎo)通路,現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠6只,體質(zhì)量為(220±10)g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供[實驗動物許可證號SCKX(軍)2007-004]。實驗過程參照并嚴格遵守美國國立衛(wèi)生研究院的《實驗動物照料和使用指南》。

1.2 試劑與儀器

異氟烷(九派制藥有限公司,中國)、兔抗5-HT抗體(rabbit anti5-HT, ab10385,Abcam,香港)、兔抗HA抗體(rabbit antiHA, ab123982, Abcam,香港)、Alexa 594熒光素化的山羊抗兔二次抗體(goat anti- rabbit Alexa 594secondary antibody, Molecular Probes,美國)、核酸特異性熒光染料DAPI(40,6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Mo- lecular Probes,美國)、Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽(Alexa fluor 488 phalloidin, MolecularProbes,美國)。

小動物麻醉機(VMR, Matrx, Midmark,美國)、蠕動泵(BT300-2J,保定蘭格恒流泵有限公司)、陽離子載玻片(Thermo, Erie Scient if ic Company,美國)、恒冷箱切片機(FSE, Thermo, MicromInternational,德國)、研究級正置顯微鏡(Olympus, BX53,日本)、全光譜掃描共聚焦顯微鏡(Olympus, FV1200,日本)。

1.3 艾灸治療

取雙側(cè)陽陵泉穴,左側(cè)進行艾灸刺激,右側(cè)為對照。定穴參考《實驗針灸學(xué)》[7]中大鼠常用針灸穴位定位法,即陽陵泉位于腓骨頭前下方凹陷處,距“后三里”穴上外側(cè)5 mm處。采用小動物呼吸麻醉機對SD大鼠進行誘導(dǎo)麻醉,分別剃除大鼠雙后肢陽陵泉穴區(qū)毛發(fā),充分暴露皮膚組織,使用艾條對左側(cè)陽陵泉穴區(qū)進行艾灸治療。艾條為大鼠動物實驗專用,呈圓柱狀,直徑為4 mm,長120 mm,重量為6 g。艾條與皮膚垂直距離(3±0.5)cm,測溫槍監(jiān)測穴區(qū)體表溫度使其保持在(44±0.5)℃,艾灸治療10 min。詳見圖1。

圖1 大鼠陽陵泉穴定位及艾灸操作

1.4 灌流取材

艾灸刺激后即刻對仍處于深度麻醉狀態(tài)下的大鼠進行心臟灌流。具體操作為,迅速剪開胸腔,經(jīng)左心室將輸液針管插入升主動脈,剪開右心耳,快速灌入生理鹽水100 mL,隨后灌入(320±10)mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液(phosphate bufferedsolution, PB, pH值為7.4)的固定液,約15 min灌流完畢。在灌流后大鼠兩側(cè)陽陵泉穴區(qū)分別縱向切取長約15 mm、寬約10 mm的皮膚組織,將其放置于上述同樣固定液中固定2 h,再換到含25%蔗糖的0.1 mol/L PB液(pH值為7.4)中,放置于4 ℃冰箱中約2 d,直至組織完全下沉。

1.5 組織切片制備

采用恒冷箱切片機進行組織切片。先用組織包埋劑將皮膚組織黏貼在支架上,待凍結(jié)后將組織制成厚20mm的矢狀切片,直接貼在陽離子載玻片上,并按順序分為兩組(艾灸組織與正常組織),然后放置于室內(nèi)陰干。

1.6 觀察指標及檢測方法

兩組組織切片用0.1 mol/L PB液清洗3次,并用組化筆在組織周圍畫圈,將封閉液[3%山羊血清,0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)]用移液器滴加到組織切片上孵育0.5 h,移去封閉液,分別滴加一次抗體兔抗5-HT抗體(1:500)和兔抗HA抗體(1:500)的稀釋液[1%山羊血清、0.5% TritonX-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)],并將裝有組織切片的濕盒置于4℃冰箱中過夜。次日經(jīng)0.1 mol/L PB液清洗后,加入含Alexa 594熒光素化的山羊抗兔二次抗體(1:500)、Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽(1:50000)、核酸特異性熒光染料DAPI(1:1000)的上述稀釋液,于室溫內(nèi)靜置1.5 h后,用0.1 mol/L PB液清洗3次。待組織切片風(fēng)干后,滴加50%甘油,加蓋玻片完成標本制作。整個操作過程中注意避光。

組織標本用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察和拍照。圖片經(jīng)Adobe Photoshop CS2(Adobe Systems, San Jose, CA,美國)進行標注和編輯。兩組組織切片在熒光顯微鏡10倍視野下分別選取12個面積相同的區(qū)域進行5-HT、HA計數(shù),并用GraphPad Prism6軟件繪制柱狀圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用配對檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

陽陵泉穴區(qū)皮膚組織的表皮下、真皮、皮下組織均有5-HT陽性標記,艾灸組織(圖2B)較正常組織(圖2A)陽性表達增多聚集,并分別在表皮層與真皮層之間及皮下組織層沿血管形成連續(xù)的增強帶;HA主要分布在正常組織和艾灸組織的真皮層深部及皮下組織的血管旁,但艾灸組織中的HA表達明顯上調(diào)(圖4);相同顯微鏡視野下5-HT和HA陽性標記數(shù)量比較(圖3、圖5),艾灸組明顯高于正常組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

需要說明的是,本研究僅對實驗結(jié)果進行了形態(tài)學(xué)描述,對其量的分析僅限于相同視野下的陽性表達物數(shù)量的統(tǒng)計分析,是為進一步證實其形態(tài)學(xué)分布趨勢而服務(wù),穴區(qū)局部皮膚組織中5-HT、HA含量變化可用生物化學(xué)技術(shù)在后期實驗中進行測定。

圖3 5-HT陽性表達細胞在正常組織和艾灸組織的計數(shù)

注:由HA、鬼筆環(huán)肽(Pha)和DAPI標記的陽陵泉穴區(qū),分別顯示為紅、綠、藍色,其中Epi、D、Sub分別代表表皮層、真皮層、皮下組織;A為HA在正常組織中的分布;B為HA在艾灸組織中的分布;A和B中箭頭的放大部位分別顯示HA在深層皮下組織(A1、B1)的分布

3 討論

本研究運用熒光免疫組化結(jié)合共聚焦成像技術(shù),從活性物質(zhì)變化的角度,探索艾灸刺激可能存在的信息傳導(dǎo)通路。通過研究發(fā)現(xiàn),艾灸可使局部皮膚組織中5-HT、HA的表達明顯增強;5-HT、HA具有明顯的趨血管性分布。

5-HT、HA作為神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子,由存在于皮膚中的內(nèi)分泌細胞和免疫細胞(包括角質(zhì)形成細胞、Merkle細胞、樹突狀細胞以及T細胞等)所分泌[8-11]。本研究結(jié)果顯示5-HT、HA陽性表達的變化與艾灸刺激對皮膚-內(nèi)分泌系統(tǒng)和皮膚-免疫系統(tǒng)的激活密切相關(guān)。朱兵等[2]證實,艾灸刺激可以通過Ad類纖維和C類纖維興奮皮膚中的溫?zé)岣惺芷骱虲-多型傷害感受器,感覺神經(jīng)元通過軸突反射釋放神經(jīng)肽到皮膚的表皮或真皮的神經(jīng)末稍,介導(dǎo)多種如內(nèi)分泌細胞和免疫細胞等靶細胞的活性,釋放相關(guān)激素和活性物質(zhì)。唐照亮等[12]亦發(fā)現(xiàn)艾灸刺激可以通過調(diào)節(jié)組織源性炎性介質(zhì)HA、5-HT,減輕或緩解炎癥反應(yīng),參與免疫調(diào)節(jié)機制。HA、5-HT具有擴血管作用[13-16],HA還可增加毛細血管的通透性,艾灸對經(jīng)穴的刺激作用,能激活血管的自律運動,改善局部微循環(huán)[17]。所以,筆者推測艾灸后血管周圍HA、5-HT的陽性表達增強與艾灸改善局部微循環(huán)作用相關(guān)。

5-HT、HA可能參與鎮(zhèn)痛作用機制的信息傳導(dǎo)。HA在腦內(nèi)對痛覺具有調(diào)節(jié)作用,在脊髓水平對痛覺具有傳導(dǎo)作用[18];在中樞下行的5-HT能神經(jīng)元能夠激活抑制性中間神經(jīng)元而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,在外周5-HT受體能夠參與疼痛信號的傳導(dǎo)[19]。筆者發(fā)現(xiàn)艾灸刺激可以通過對HA、5-HT表達的調(diào)控參與鎮(zhèn)痛作用機制的信息傳導(dǎo),這與楊介賓等[20]發(fā)現(xiàn)艾灸可調(diào)控致痛因子HA、5-HT而實現(xiàn)鎮(zhèn)痛的效應(yīng)觀點一致。另外,相關(guān)臨床研究[21-24]和動物實驗[25-27]均證明,艾灸能夠通過調(diào)節(jié)結(jié)腸的5-HT通路來實現(xiàn)降低腸易激綜合征患者或大鼠的內(nèi)臟痛的程度。

總之,正常情況下皮膚處于穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu),艾灸刺激可以打破這種穩(wěn)態(tài),使其由靜止轉(zhuǎn)為激活狀態(tài),其中5-HT和HA成分的增加表明其可能參與艾灸作用通路信息傳遞過程。以本研究為基礎(chǔ),深入探討艾灸刺激對穴區(qū)活性物質(zhì)的表達變化的影響,不僅有助于在生物學(xué)層面上揭示艾灸作用機制的始動環(huán)節(jié),而且使灸刺激不同穴區(qū)活性物質(zhì)表達的共性和特異性研究成為可能。本研究結(jié)果提示從穴區(qū)局部組織入手研究與艾灸始動環(huán)節(jié)密切相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)將會成為今后艾灸作用機制研究的一個重要發(fā)展方向。

[1] 張延君.艾灸的應(yīng)用研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2015,13(19):89-90.

[2] 朱兵.系統(tǒng)針灸學(xué)-復(fù)興“體表醫(yī)學(xué)”[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:20,78,92.

[3] 鐘藍.傳統(tǒng)艾灸作用機理初探[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,1999,5(6):46-47.

[4] 陳漢平.關(guān)于針灸調(diào)節(jié)作用規(guī)律與機制的思考[J].上海針灸雜志,1992,11(1):39.

[5] 徐東升,佘琛,王佳,等.大鼠“太沖”穴區(qū)皮膚組織中血管和神經(jīng)纖維的顯微結(jié)構(gòu)特征[J].針刺研究,2016, 41(6):486-491.

[6] 何偉,吳美玲,景向紅,等.穴位的本態(tài):穴位組織細胞化學(xué)的動態(tài)變化[J].中國針灸,2015,35(11):1181- 1186.

[7] 余曙光.實驗針灸學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2009:151.

[8] Bertrand PP, Kunze WA, Furness JB,.The terminals of myenteric intrinsic primary afferent neurons of the guinea-pig ileum are excited by 5-hydroxytryptamine acting at 5-hydroxytryptamine-3 receptors[J]., 2000,101(2):459-469.

[9] Nonkes LJ, van Bussel IP, Verheij MM,.The interplay between brain 5-hydroxytryptamine levels and cocaine addiction[J]., 2011,22(8): 723-738.

[10] Wang Z, Wu J, Wu S,.High-performance liquid chromatographic determination of histamine in biological samples: the cerebrospinal fluid challenge--a review[J]., 2013,(774):1-10.

[11] Jin CY, Wei H, Karlstedt K,.Histamine in the locus coeruleus attenuates neuropathic hypersensitivity[J]., 2017,4(4):259-260.

[12] 唐照亮,宋小鴿,章復(fù)清,等.艾灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗炎免疫作用機理的研究[J].針刺研究,2003,28(4): 292-294.

[13] 楊松,侯平.左心疾病相關(guān)性肺動脈高壓診療簡況[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2016,30(7):121-123.

[14] 于春利,馬魯波,張童,等.鹽酸沙格雷脂在膝下動脈硬化閉塞腔內(nèi)治療術(shù)后下肢缺血中的作用[J].中華普通外科雜志,2013,28(11):871-873.

[15] 袁勇,朱洪.乙型肝炎患者血清HA與AngⅡ的相關(guān)性研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2013,42(26):3120-3121.

[16] 呂國蔚.醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)[M].第2版.北京:高等教育出版社,2004:94-95,103-105.

[17] 張青元,胡淑萍.艾灸機理研究現(xiàn)狀與探析[J].上海針灸雜志,2008,27(5):47-50.

[18] 汪慧菁,姚明輝.組胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對痛覺傳導(dǎo)的影響[J].中國臨床康復(fù),2004,8(35):8086-8088.

[19] 孔二亮,吳飛翔,俞衛(wèi)鋒.5-羥色胺受體及其在疼痛調(diào)控中的研究進展[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2016,37(12): 1517-1523.

[20] 楊介賓,宋開源,梁繁榮,等.不同針灸療法對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠外周鎮(zhèn)痛機理的研究[J].中國針灸,1999,19 (6):362-366.

[21] Weaver CT,Harrington LE,Mangan PR,. Th17: an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties[J]., 2006,24(6):677-688.

[22] 楊振斌,方曉華,劉先勇,等.雷火灸聯(lián)合中藥灌腸治療脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎32例臨床觀察[J].湖南中醫(yī)雜志,2017,33(7):95-97.

[23] 陳潔,劉軍,樓曉軍,等.艾盒灸神闕穴佐治脾虛證輕中度潰瘍性結(jié)腸炎33例觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2016, 51(7):515-516.

[24] 安彩萍,黃燕,馬曉芃,等.隔藥灸對克羅恩病腸纖維化大鼠結(jié)腸成纖維細胞CTGF、FN、Smad表達的影響[J].上海針灸雜志,2014,33(6):487-491.

[25] Zhou EH, Liu HR, Wu HG,. Herb-partition moxibustion relieves chronic visceral hyperalgesia and 5-HT concentration in colon mucosa of rats[J]., 2009,31(7):734-737.

[26] Zhou EH,Liu HR,Wu HG,. Suspended moxibustion relieves chronic visceral hyperalgesia via serotonin pathway in the colon[J]., 2009,451(2): 144-147.

[27] 楊玲,吳璐一,竇傳字,等.隔藥灸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜MyD88及TRAF6表達的影響[J].上海針灸雜志, 2013,31(9):1864-1866.

Effect of Moxibustion on the Expressions of 5-Hydroxytryptamine and Histamine in Skin Tissue at Yanglingquan (GB34)

1,2,2,2,1,2.

1.,712046,; 2.100700,

To investigate the influence of moxibustion on the expressions of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and histamine (HA) in skin tissue at Yanglingquan (GB34) by using immunohistochemistry combined with confocal technique.The rat was used in this experiment. The skin tissue on hind limbs Yanglingquan (GB34) was exposed by shaving. Subsequently, moxibustion was carried out on the left side of Yanglingquan (GB34). After moxibustion, the local skin tissue of 1 cm × 1.5 cm on bilateral Yanglingquan (GB34) of rats were collected, and put into 25% sucrose solution. The tissues were sliced at 20mm on a cryostat. The 5-HT and HA antibodies were used for fluorescent immunohistochemical test.The positive expressions of 5-HT and HA increased in the local skin tissue after moxibustion, in which 5-HT increased between the epidermis and dermis, in subcutaneous tissue layer forming a continuous band of enhancement along the blood vessels, while HA was majorly distributed nearby the blood vessels of deep dermis and subcutaneous tissue. After counting the positively-expressed 5-HT and HA by microscopic field of view, the numbers of 5-HT and HA positive markers were significantly lager in post-moxibustion skin tissue than in normal skin tissue. The differences were statistically significant (＜0.05).Moxibustion plays a role in up-regulating the level of 5-HT and HA in the local skin tissue at Yanglingquan (GB34). It suggests that 5-HT and HA may be involved in the signal transduction of moxibustion-related pathways.

Moxibustion; 5-Hydroxytryptamine; Histamine; Acupoint, Yanglingquan (GB34)

1005-0957(2018)13-0103-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.13.0103

2018-02-12

國家自然科學(xué)基金項目(81674079);北京市自然科學(xué)基金項目(17G40199)

陳虹(1988—),女,2015級碩士生,Email:799678916@qq.com

王瑩瑩(1981—),女,主任醫(yī)師,博士,Email:YYW261206@126.com