陸軍，董浩然，鄭旭媛

（天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，天津300070）

焦慮癥是一種以持續(xù)性緊張、擔(dān)心、恐懼或發(fā)作性驚恐為特征的情緒障礙，伴有植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和運動不安等行為特征[1]。高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）是國際上公認(rèn)的測量嚙齒動物焦慮反應(yīng)的方法[2]。焦慮狀態(tài)與內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）活動相關(guān)[3-4]，但其產(chǎn)生機(jī)制尚未清楚。在本次研究中，利用16通道微電極陣列記錄成年SD大鼠在熟悉環(huán)境（Familiar）和高架十字迷宮的內(nèi)側(cè)前額葉皮層局部場電位（local field potentials，LFPs），對LFPs進(jìn)行時頻分析和腦網(wǎng)絡(luò)分析，評估焦慮環(huán)境對大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層LFPs功能連接的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠8 只，10～12 周齡，體質(zhì)量 250～300 g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)地點為天津醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。動物室內(nèi)每天12 h光照，12 h黑暗。對大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)（每籠3～4只）。飼養(yǎng)期間保持安靜舒適的環(huán)境（室溫23℃±2℃、濕度 50%±10%）。

1.1.2 高架十字迷宮 有兩個開放臂（長×寬為50 cm×10 cm）、兩個相對的封閉臂（長×寬×高為50 cm×10 cm×40 cm）、一個連接4個臂的中央平臺（10 cm×10 cm），開放臂、封閉臂和平臺區(qū)底部均為灰色，且前兩者互相垂直成十字狀；每個臂附在50cm高的塑料底架上。

1.2 實驗方法

1.2.1 植入多通道微電極陣列 應(yīng)用40 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉（Sigma，America）麻醉后，頭部固定在立體定位儀上（Lab StandardTM，America），頭頂部去毛并常規(guī)消毒皮膚，沿顱頂中線剪開皮膚，暴露頭骨及前囟，依據(jù)George Paxions&Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜，于前囟（AP）前 2.5～4.5 mm，中線右側(cè)（MR）旁開 0.2～1.0 mm，用牙科鉆在顱骨上開一個矩形的窗口，露出硬腦膜并將其挑破。再鉆3～4個孔用以安置不銹鋼螺釘作為固定。16通道微電極陣列（Plexon，America）垂直植入腦組織表面向下2.5～3.0 mm[5]，利用牙科水泥固定用不銹鋼螺釘和電極陣列，形成一個整體，以保證固定強(qiáng)度。手術(shù)后大鼠應(yīng)當(dāng)單籠飼養(yǎng)，并經(jīng)常撫摸和抓握大鼠，使其熟悉實驗者，待動物恢復(fù)5～7 d后，進(jìn)行信號記錄。

1.2.2 LFPs記錄 記錄熟悉環(huán)境LFPs時，將大鼠放入一個60 cm×60 cm×35 cm的鼠籠中，任其自由探究10 min并記錄LFPs；記錄焦慮環(huán)境LFPs時，將大鼠頭朝開放臂置于EPM的中央?yún)^(qū)，釋放后任其自由探究10 min并記錄LFPs。微電極陣列所記錄到的 LFPs，經(jīng)微型 Headstage（Plexon，America）由信號傳輸導(dǎo)線傳送到前置放大器處理，進(jìn)行5 000倍放大，然后經(jīng)過A/D轉(zhuǎn)換變成數(shù)字信號，通過光纖快速傳輸進(jìn)入OmniPlex神經(jīng)信號處理系統(tǒng)（Plexon，America）處理后，作為原始數(shù)據(jù)存儲在計算機(jī)中。應(yīng)用的LFPs信號采樣率為2 kHz。

1.3 LFPs處理

1.3.1 多通道LFPs的時頻分析 原始記錄數(shù)據(jù)經(jīng)過截止頻率為500 Hz低通濾波，利用加權(quán)最小二乘的局部線性回歸與擬合方法消除16通道LFPs信號中夾雜的基線漂移與工頻干擾，剔除原始數(shù)據(jù)差分記錄中的參考通道和漂移過大的通道，獲取零均值16通道LFPs。高架十字迷宮中大鼠自由探究10s的LFPs作為研究對象，8只大鼠共140段LFPs（rat1=15 trials，rat2=18 trials，rat3=19 trials，rat4=18 trials，rat5=18 trials，rat6=20 trials,rat7=15 trials，rat8=17 trials）。應(yīng)用短時傅里葉變換（short-time fourier transform，STFT）計算大鼠在熟悉環(huán)境和高架十字迷宮中前額葉皮層LFPs的能量密度分布。STFT的基本思想是假定信號在一個短時間間隔內(nèi)是平穩(wěn)的，滑動窗函數(shù)g（t），計算出各個不同時刻的功率譜。信號x(t)的STFT定義為：

式中 g（t）是窗函數(shù)，f為頻率。

選取漢明窗，窗口長度為1 000 ms，窗口移動步長為250 ms，經(jīng)過STFT變換，可以獲得每個通道LFPs信號的時頻能量分布，再計算16通道LFPs的平均時頻能量分布，便可獲得大鼠在高架十字迷宮焦慮狀態(tài)過程中LFPs能量密度的時間-頻率分布特征模式。根據(jù)時頻分布特性，選取能量密度大的頻段作為與焦慮狀態(tài)相關(guān)的特征頻段，并應(yīng)用帶通濾波方法提取特征頻段分量。

1.3.2 LFPs功能連接 基于多變量自回歸模型（MVAR）的定向傳遞函數(shù)分析方法計算LFPs因果連接矩陣，以多通道LFPs的每一個通道作為一個節(jié)點構(gòu)建LFP因果網(wǎng)絡(luò)[6-7]，計算LFP因果網(wǎng)絡(luò)的平均連接強(qiáng)度。

設(shè)16通道LFPs為X（t）=[X1（t），X2（t），…，XN（t）]T，建立 MVAR 模型如下：

式中，A(n)為16*16的系數(shù)矩陣，E(t)為白噪聲，p為MVAR模型的階數(shù)，采用貝葉斯信息準(zhǔn)則（bayesian information criterion，BIC）確定模型階數(shù)。

MVAR模型經(jīng)傅里葉變換轉(zhuǎn)換到頻域：

式中，f表示頻率。

H=A-1，是頻域系數(shù)矩陣A的逆矩陣，也稱為系統(tǒng)的傳遞矩陣。

定向傳遞函數(shù)（directed transfer function，DTF）定量描述LFPs之間的連接強(qiáng)度?；趥鬟f矩陣H，從通道j到通道i的因果連接值定義如下：

式中，γij表示歸一化后，通道j對通道i的影響在所有通道對通道i的影響中所占的比例，γij越大說明通道j對通道i的因果連接越強(qiáng)，反之則越弱。k為通道數(shù)。

將LFPs的第i個電極記錄通道定義為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點i，將每個通道LFP間的DTFij的倒數(shù)定義為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點j到i之間的邊長，構(gòu)建LFP因果網(wǎng)絡(luò)。計算LFP網(wǎng)絡(luò)的DTF連接矩陣的平均DTF：

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用表示，組間差異采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LFPs時頻分析結(jié)果 計算8只大鼠在Familiar和EPM中前額葉皮層LFPs的平均能量密度分布。由時頻分析結(jié)果可觀察到LFPs能量集中在theta頻段（4～12 Hz）,并且在 EPM 中 theta頻段的能量高于Familiar，能量分別為12.581±0.345和10.653±0.173（P＜0.05）（圖 1A、1B）。

圖1 在Familiar和EPM的LFPs時頻分析結(jié)果Fig 1 TheLFPstimefrequencypowerspectruminFamiliarandEPM

2.2 LFPs功能連接結(jié)果 根據(jù)特征頻段提取theta分量，計算大鼠在Familiar和EPM中theta分量的定向傳遞函數(shù)DTF，得到可以直接描述功能連接的矩陣，計算矩陣中元素的平均值，得到DTF值，結(jié)果如圖2所示。在EPM中theta頻段的功能連接高于Familiar，DTF 值分別為 0.031±0.002 和 0.022±0.001（P＜0.05）（圖2A、2B）。

圖2 在Familiar和EPM的LFPs的功能連接結(jié)果Fig 2 The LFPs functional connectivity in Familiar and EPM

3 討論

高架十字迷宮實驗既是建立焦慮應(yīng)激的模型也是測量焦慮反應(yīng)的經(jīng)典方法[8]。其原理是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾沖突來考察大鼠的焦慮狀態(tài)[9]。目前多通道同步記錄技術(shù)可以長時間同步記錄實驗動物在清醒狀態(tài)下自由活動的神經(jīng)信號，成為焦慮相關(guān)腦區(qū)的研究中非常有效的工具。

內(nèi)側(cè)前額葉皮層是參與焦慮活動的重要腦區(qū)之一[10]。焦慮活動期間mPFC的theta頻段的增加促進(jìn)接收來自其他腦區(qū)輸入的感覺、運動信息，比如mPFC與腹側(cè)海馬、內(nèi)嗅皮層、杏仁核等腦區(qū)內(nèi)theta活動同步性增加促進(jìn)對外來反感信息的響應(yīng)，抑制對焦慮環(huán)境的探索行為[11]。Adhikari等[12]利用高架十字迷宮測試大鼠的焦慮活動時mPFC局部場電位，分析mPFC的焦慮相關(guān)的放電模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)焦慮狀態(tài)時mPFC的theta頻段能量在迷宮的反感區(qū)域增加，在安全區(qū)域減少，并認(rèn)為大鼠mPFC的theta振蕩影響大鼠在焦慮環(huán)境下的探索行為。

大腦功能網(wǎng)絡(luò)是對任務(wù)執(zhí)行期間大腦結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)上不同的神經(jīng)元、神經(jīng)元集群或腦區(qū)之間動態(tài)活動交互整合的直觀描述。在腦網(wǎng)絡(luò)層次上，基于磁共振成像，腦電圖、腦皮層電圖和腦磁圖的研究能夠深入理解大腦疾病的神經(jīng)機(jī)制，比如焦慮癥、抑郁癥和癲癇等[13-14]。Paceschott等[15]利用功能磁共振（fMRI）研究具有原發(fā)性失眠的焦慮癥患者的腦功能網(wǎng)絡(luò)時，發(fā)現(xiàn)與失眠癥患者相比，原發(fā)性失眠的焦慮癥患者左側(cè)杏仁核和雙側(cè)前喙扣帶皮質(zhì)大腦功能連接減弱，失眠癥患者杏仁核對下行控制的減少會增加罹患焦慮癥的風(fēng)險。功能網(wǎng)絡(luò)連接的參數(shù)在大腦疾病的臨床診斷中有很好的潛在應(yīng)用價值。

本次研究中，對獲取的大鼠mPFC LFPs時頻分析發(fā)現(xiàn)在EPM時theta頻段的能量高于Familiar，證實了theta頻段的能量增加與焦慮狀態(tài)相關(guān)。進(jìn)一步對theta分量網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能連接分析，發(fā)現(xiàn)在EPM時theta頻段的功能連接強(qiáng)于Familiar，提示theta分量網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度的改變可能影響theta能量，從而對焦慮樣行為作出調(diào)控。已有研究表明，焦慮癥不僅與前額葉有關(guān)，還涉及海馬和杏仁核等腦區(qū)[16-17]，而且除了theta振蕩，其他的大腦節(jié)律也可能參與焦慮活動，比如在EPM時theta-gamma耦合減少[18]。下一步可以對這些腦區(qū)之間的神經(jīng)振蕩的交互作用進(jìn)行研究。利用電生理技術(shù)記錄神經(jīng)信號和腦網(wǎng)絡(luò)分析方法可以更加深入地了解與焦慮相關(guān)腦區(qū)問題，為研究焦慮癥神經(jīng)機(jī)制提供支持。