李偉，王兆松，董秋萍，徐玥，陳永孜，許世磊

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

肺鱗狀上皮細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCC）是原發(fā)性肺癌中常見的一種[1]，但其對放療、化療不敏感[1-2]。因此找到更好的治療靶點(diǎn)，對于治療肺鱗癌具有重要的意義。已有研究表明，HsamiR-144可以通過調(diào)控TIGAR基因來抑制肺癌的增殖并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡和自噬[3]，miR-144可以通過影響GLUT1影響腫瘤的代謝[4-7]，還可以通過AP-4影響非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移[8]。miR-144影響腫瘤的研究中往往只針對其中一個靶基因，而miRNA在細(xì)胞中通常會調(diào)控多種靶基因，目前對于肺鱗癌相關(guān)miR-144靶基因綜合的研究還未見報道，本文采用多種生物信息學(xué)的手段，綜合分析了miR-144的靶基因及其相關(guān)的一些生物學(xué)特征信息，并依據(jù)TCGA中肺鱗癌患者的數(shù)據(jù)，深入分析了miR-144靶基因的相關(guān)信息，以期為其在肺鱗癌治療方面的作用提供理論支持[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)材料 通過網(wǎng)站 UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapages/）下載已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理的TCGA數(shù)據(jù)庫中肺鱗狀細(xì)胞癌患者數(shù)據(jù)（更新時間2016年4月）。

1.1.2 分析軟件及數(shù)據(jù)庫 SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，GraphPad Prims 7統(tǒng)計分析軟件，Cytoscape 3.5.0系統(tǒng)生物學(xué)分析軟件（http：//www.cytoscape.org/）；miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫 Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、TargetMiner （http：//www.isical.ac.in/～bioinfo_miu/targetminer20.htm）、miRDB（http：//www.mirdb.org/miRDB/）、PicTar （http：//pictar.mdcberlin.de/）；靶基因綜合分析網(wǎng)站 Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；DAVID信號通路分析網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 方法交叉表分析肺鱗癌患者 miR-144表達(dá)量與性別、年齡的相關(guān)性，并分析表達(dá)量與總生存率（overall survival，OS） 間關(guān)系并作圖；通過Targetscan、Targetminer、miRDB 和 PicTar數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-144靶基因，利用Venny 2.1軟件綜合分析4個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果并預(yù)測得到miR-144的候選靶基因；使用GraphPad Prims 7軟件對患者的癌與癌旁組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)，分析靶基因在組織間的表達(dá)差異；使用BinGo插件對靶基因進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析；DAVID分析靶基因參與的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 miR-144與患者總生存率間關(guān)系 下載并篩選出458例TCGA中收錄了miR-144的表達(dá)量及OS的肺鱗癌病例。簡單整理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，458例患者中miR-144的最高表達(dá)量10.19，最低表達(dá)量為2.29，中位數(shù)為 6.277，均值為 6.256，方差為 2.163。以其表達(dá)量中位數(shù)（6.277）為界限分為高表達(dá)組（共229例）和低表達(dá)組（229例）。年齡方面，40歲為其最低年齡，90歲為最大統(tǒng)計年齡，年齡中值為68歲，平均年齡67.55歲，方差73.612，按其中位數(shù)將所有統(tǒng)計患者分為低齡和高齡兩組，交叉表分析發(fā)現(xiàn)miR-144表達(dá)量與患者年齡無必然聯(lián)系（P＞0.05）。從性別方面分析，所有統(tǒng)計患者中，男性有338例，女性患者120例，交叉表分析發(fā)現(xiàn)miR-144表達(dá)量與性別也無必然聯(lián)系（P＞0.05），具體結(jié)果見表1。

表1 肺鱗癌患者miR-144表達(dá)量與年齡、性別交叉表分析Tab 1 Cross-Tabulations analysis of miR-144 expression level and age,gender in patients with lung squamous cell

SPSS繪制miR-144表達(dá)量與總生存率的生存函數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)miR-144高表達(dá)組的總生存率比低表達(dá)組的高，且P=0.003（小于0.05），生存函數(shù)圖如圖1所示。因此miR-144的高表達(dá)有利于延長肺鱗癌患者的總生存時間，并且這種影響與患者的年齡和性別無關(guān)。

圖1 肺鱗癌患者miR-144表達(dá)量與總生存率分析Fig 1 MiR-144 expression and overall survival(OS)analysis in patients with lung squamous cell

2.2 miR-144在肺鱗癌患者與其正常組織間表達(dá)差異分析 對TCGA中的肺鱗癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選，得到了43例即收錄了癌組織又收錄相應(yīng)的癌旁正常組織表達(dá)信息的患者，這43例癌組織的hsa-miR-144的表達(dá)均值為6.248 6，最大值為9.810 2，最小值 2.294 7，方差為 2.328 0；癌旁組織的hsa-miR-144的表達(dá)均值為9.517 2，最大值為12.085 4，最小值5.244 0，方差為1.806 4。使用GraphPad Prism 7對43對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本的t檢驗(yàn)分析，得到如圖2所示的點(diǎn)狀圖，腫瘤組織中miR-144的表達(dá)量遠(yuǎn)低于癌旁正常組織，并且其P＜0.000 1，提示miR-144的表達(dá)對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。

圖2 肺鱗癌患者癌與癌旁miR-144表達(dá)量分析（****：P＜0.000 1）Fig 2 Expression analysis of miR-144 in tumor and normal tissue from patients with lung squamous cell carcinoma(****：P＜0.000 1)

2.3 miR-144靶基因的預(yù)測 通常一個miRNA調(diào)控多靶基因的表達(dá)，不同數(shù)據(jù)庫的預(yù)測會得到不同的結(jié)果，為了能準(zhǔn)確地預(yù)測，綜合多個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，并將每個數(shù)據(jù)庫中均出現(xiàn)的基因作為最終候選靶基因。

本 文 采 用 Targetscan、miRDB、Targetminer 和PicTar4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-144靶基因，分別得到了1043、569、2228和397個靶基因。通過在線綜合分析工具Venny 2.1綜合分析并最終得到了一個共有72個基因的集合，如圖3所示，這個集合中包括了 ABCA1、CAV2、HOXA10、MOB2、SS18、ZFX 等基因，因此，可以認(rèn)為這72個基因是miR-144的候選靶基因。

2.4 肺鱗癌患者中miR-144靶基因的表達(dá)差異分析 分析肺鱗癌患者的癌與癌旁組織間所有靶基因的表達(dá)，通過表達(dá)差異分析，確定有顯著性差異的基因?yàn)閙iR-144影響肺鱗癌進(jìn)展的靶基因。篩選得到了TCGA數(shù)據(jù)庫中36例肺鱗癌患者的配對表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)包含癌與癌旁組織的所有RNA測序數(shù)據(jù)，并已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。36例患者癌和癌旁正常組織的72個候選靶基因表達(dá)數(shù)據(jù)主要包括每個基因在癌與癌旁正常組織的極值、均值、方差。使用GraphPad Prims對上述72個基因在不同組織的表達(dá)進(jìn)行配對樣本的t檢驗(yàn)，其中在腫瘤組織和配對的正常組織中表達(dá)具有明顯的差異（P＜0.05）有45個基因，其中在癌旁組織中高表達(dá)的有30（66.67%）個，15（33.33%）個基因在腫瘤中高表達(dá)，見表2。

圖3 miR-144靶基因分析示意圖Fig 3 Illustration of miR-144 target gene analysis

表2 癌與癌旁正常組織miR-144靶基因表達(dá)差異情況Tab 2 The different expression of miR-144 target gene in tumor and normal tissue

2.5 miR-144靶基因GO注釋分析 基因本體論（gene ontology，GO）是通過對基因及其產(chǎn)物在細(xì)胞中參與的生物學(xué)過程、組成成分以及分子功能對基因及產(chǎn)物進(jìn)行描述。為進(jìn)一步分析miR-144的靶基因在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對篩選出的45個差異表達(dá)的靶基因通過分析軟件Cytoscape的BiNGO插件進(jìn)行GO注釋富集分析，設(shè)置物種為人類（Homo sapiens），差異水平 0.05，注釋文件選擇所有（All）。結(jié)果顯示可知，從細(xì)胞組成方面看部分靶基因參與細(xì)胞核以及星形微管、細(xì)胞質(zhì)中顆粒等的組成。這些基因參與包括肌肉形成、胚胎發(fā)育、神經(jīng)元遷移、上皮細(xì)胞增生、RNA轉(zhuǎn)錄等等多達(dá)50項生物學(xué)過程，另外還參與了代謝過程。從參與的分子學(xué)過程看主要行DNA結(jié)合功能，這有利于其參與RNA轉(zhuǎn)錄的過程，另外還有一些蛋白質(zhì)的結(jié)合功能。2.6 miR-144靶基因KEGG通路分析 通過GO富集分析對miR-144靶基因的功能進(jìn)行初步解析，但基因通常是通過參與機(jī)體的信號通路對生命活動進(jìn)行調(diào)節(jié)的，本文通過DAVID對45個候選靶基因進(jìn)行信號通路分析。其中16個靶基因參與了多達(dá)37個信號通路，F(xiàn)BXW11參與了7個信號通路，包括蛋白質(zhì)泛素化降解，Wnt信號通路，Hedgehog信號通路，Hippo信號通路等，其中Wnt和Hippo信號通路對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響。ETS1，CAV2參與的信號通路對腫瘤的遷移侵襲具有重要影響。

3 討論

本文對miR-144的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并聯(lián)系肺鱗癌患者的臨床及基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以期能夠?qū)εR床研究提供指導(dǎo)意義。一個miRNA往往會調(diào)控多個靶基因表達(dá)，筆者發(fā)現(xiàn)miR-144共有72個候選靶基因，其中45個在肺鱗癌患者癌與癌旁正常組織間表達(dá)差異明顯。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)miR-144靶基因的產(chǎn)物參與細(xì)胞核組成，另外還與星形微管、細(xì)胞質(zhì)中顆粒形成有關(guān)。miR-144與肌肉的形成、個體胚胎發(fā)育、上皮細(xì)胞增生、RNA轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程有關(guān)，其靶基因還參與了人體的新陳代謝過程[10-12]。分子功能中DNA結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合等功能，都有利于其參與相應(yīng)的生物過程[13-14]。

miR-144靶基因的KEGG通路分析可幫助我們更好地了解其在生命活動中參與的信號通路。miR-144可以通過影響Ras信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路等調(diào)控肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展[15-16]，當(dāng)miR-144的表達(dá)發(fā)生變化時，整個細(xì)胞中基因的表達(dá)發(fā)生變化，一系列的信號通路也隨之變化，進(jìn)而影響了腫瘤的進(jìn)展過程。miR-144在正常組織中表達(dá)量高于癌組織，且其高表達(dá)可有效延長肺鱗癌患者的總生存時間，因此，綜合分析miR-144靶基因的相關(guān)信息，可為深入研究其在肺鱗癌患者中的作用機(jī)制提供重要理論數(shù)據(jù)支持。