姜曉芳，陳 霞，楊 艷，馮 靜

（中國人民解放軍第324醫(yī)院兒科，重慶 400020）

急性肺損傷（ALI）可以由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等多種因素導(dǎo)致，臨床常見為急性進(jìn)行性加重的呼吸困難和難以糾正的低氧血癥[1]。雖然國內(nèi)外學(xué)者致力于ALI的防治研究已有多年，但發(fā)病率仍居高不下，病死率高達(dá)30% ～40%[2]。目前，ALI的細(xì)胞模型建立最多見的是采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)[3]，但誘導(dǎo)濃度以及細(xì)胞模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，使用的LPS誘導(dǎo)濃度相差可達(dá)10倍以上，導(dǎo)致研究的標(biāo)準(zhǔn)不易掌握?；诖?，本研究中通過采用不同質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞活性的變化，為ALI相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1．1 試劑、材料與儀器

LPS(Sigma，L2880)；CCK －8 試劑盒（日本同仁）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；特級胎牛血清（GIBCO）；細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST）；人肺上皮細(xì)胞株（A549，南京科佰生物科技有限公司）。ReverTra Ace－a－二步法RT－PCR KIT（日本東洋紡）；超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；倒置顯微鏡（Leica公司）。

1．2 方法

用不同質(zhì)量濃度 LPS（0．050，0．100，0．125，0．250，0．500，1．000，5．000，10．000，50．000，100．000 μg ／mL）刺激人肺上皮細(xì)胞建立ALI細(xì)胞模型，48 h后應(yīng)用CCK－8試驗(yàn)檢測不同質(zhì)量濃度的LPS對人肺上皮細(xì)胞的活性的影響。采用寶生物公司RNAiso Plus提取細(xì)胞總 RNA，然后采用寶生物公司 SYBR．Premix Ex TaqTMII進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，引物序列如下。

細(xì)胞間黏附分子－1(ICAM－1)F － 5′GCCCGAGCTCAAGTGTCTAA 3′R － 5′GGAGAGCACATTCACGGTCA3′

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

繪圖及數(shù)據(jù)分析使用Excel和SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件完成。計(jì)量資料以s表示，兩組獨(dú)立樣本采用 t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞48 h后細(xì)胞活性的變化

不同質(zhì)量濃度LPS刺激人肺上皮細(xì)胞48 h，結(jié)果見圖1?？梢?，10 μg／mL LPS即可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞活性明顯下降，與 5 μg／mL LPS比較差異顯著（P ＝0．020 6＜0．05）。當(dāng)LPS質(zhì)量濃度為10～50 μg／mL時，細(xì)胞活性處于平臺期，差異不顯著，但高于50 μg／mL時肺上皮細(xì)胞活性再次出現(xiàn)明顯下降，與100 μg／mL LPS比較有顯著差異（P ＝0．040 8＜0．05）。

圖1 不同質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞48 h后細(xì)胞活性變化

2．2 LPS刺激人肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化

結(jié)果見圖2。當(dāng) LPS質(zhì)量濃度高于50 μg／mL時，肺上皮細(xì)胞壞死比較明顯；當(dāng)LPS質(zhì)量濃度低于10 μg／mL時，肺上皮細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。

圖2 光鏡下不同質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞形態(tài)(×100)

2．3 LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞48hICAM－1mRNA表達(dá)量

LPS 質(zhì)量濃度為 0，5，10，50，100，200 μg／mL 時，誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞48 h ICAM－1 mRNA表達(dá)量分別為1，(5．5 ± 1．4)，(12．5 ± 7．8)，(23．7 ± 7．5)，(25．8 ± 5．1)，(28．5 ±9．4)μg／mL。其中 10，50 μg／mL 時 A549 細(xì)胞ICAM－1 mRNA表達(dá)量與 5 μg／mL LPS比較有顯著升高（P ＝ 0．016 9，0．005 ＜ 0．05）。

3 討論

ALI模型是研究ALI／急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發(fā)病機(jī)制、有效療法的重要實(shí)驗(yàn)手段[4]，病理特征可表現(xiàn)為肺微血管和肺泡上皮損傷、肺毛細(xì)血管通透性增加等。現(xiàn)國內(nèi)外已成功建立創(chuàng)傷性、放射性、內(nèi)毒素性多種肺損傷模型，但最經(jīng)典模型為LPS誘導(dǎo)的ALI細(xì)胞或動物模型。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，對宿主有害，可引起發(fā)熱、白細(xì)胞反應(yīng)、內(nèi)毒素血癥等。LPS引起的全身敗血癥是ALI／ARDS的常見病因，在許多ALI患者的肺組織中，無論有無細(xì)菌感染，都能檢測到革蘭陰性菌內(nèi)毒素LPS的存在[5－6]。

目前，關(guān)于ALI動物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)和方法已較成熟，如腹腔注射LPS、氣管滴注LPS及尾靜脈注射LPS是典型的原發(fā)性或繼發(fā)性ALI模型，也稱為間接或直接ALI模型[7－9]。但尚無 ALI細(xì)胞模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)生ALI時，主要病理學(xué)特征表現(xiàn)為上皮細(xì)胞損傷和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤和滲透性肺水腫的形成[10]。故國內(nèi)外現(xiàn)大多采用LPS直接誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞活性及細(xì)胞因子水平的變化[11]，特別是肺上皮細(xì)胞的凋亡，可誘導(dǎo)大量肺上皮細(xì)胞丟失，促發(fā)ALI的進(jìn)展[12]。CCK－8法是檢測細(xì)胞增殖／毒性的常見試驗(yàn)[13－14]。ICAM－1是參與許多炎癥性疾病的重要病理生理基礎(chǔ)，是ALI發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子標(biāo)志[15－16]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用不同質(zhì)量濃度LPS刺激人肺上皮細(xì)胞48 h后，10 μg／mL LPS即可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞活性明顯下降（P＜0．05），但細(xì)胞壞死不明顯。LPS質(zhì)量濃度高于50 μg／mL時，肺上皮細(xì)胞活性持續(xù)下降，但細(xì)胞壞死比較明顯。建議LPS實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度控制在10～50 μg／mL為宜。本研究中對 LPS誘導(dǎo)后的肺上皮細(xì)胞代表性炎性因子 ICAM－1 mRNA測定發(fā)現(xiàn)，LPS質(zhì)量濃度為10 μg／mL時，ICAM－1 mRNA表達(dá)量與5 μg／mL LPS有顯著差異；但 LPS質(zhì)量濃度高于50 μg／mL 時，如 100 μg／mL 時 ICAM －1 mRNA 表達(dá)量與50 μg／mL比較無顯著差異。進(jìn)一步提示LPS質(zhì)量濃度控制在10～50 μg／mL對ALI細(xì)胞模型的意義。

本研究中為建立ALI細(xì)胞模型的標(biāo)準(zhǔn)提供了較準(zhǔn)確的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但由于細(xì)胞株及LPS來源不同可能會存在一定濃度差異。在下一步研究中，課題組也將繼續(xù)尋找能更加準(zhǔn)確反映ALI的發(fā)生和發(fā)展過程的細(xì)胞病理學(xué)或免疫學(xué)變化指標(biāo)。