吳建明，丁京偉，趙 準，朱 婷，葉志學，沈漢福，沈彩虹

（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000）

清熱解毒分散片為復方中成藥，其配方起源于清熱解毒片，由生石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、甜地丁、黃芩、龍膽、板藍根、知母、麥冬12味中藥組方，功能主治為清熱解毒，用于治療流感、上呼吸道感染及各種發(fā)熱性疾病[1]。分散片是指在水中能迅速崩解并均勻分散的片劑[2]，中藥分散片同時具備液體制劑和固體制劑的獨特優(yōu)勢，分散度大，溶出迅速，生物利用度高，服用方式多樣化，制備方法簡單易行，是一種應用前景廣闊的中藥口服新劑型[3]。金銀花為方中君藥，具有清熱解毒、疏散風熱之功效。綠原酸類化合物如綠原酸和異綠原酸是金銀花的主要有效成分，綠原酸為其主要活性成分之一[4]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定金銀花中綠原酸含量，進一步對清熱解毒分散片進行質(zhì)量控制[5]221?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1311A泵、G1329A進樣器、G1314B檢測器、G1316A柱溫箱（美國安捷倫公司）；BS124S型電子分析天平（檢測精度為0．1‰，德國賽多利斯股份有限公司）；KQ－500DB型超聲波清洗器（功率為500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)以 99．3%計，批號為 110753－201716）；清熱解毒分散片（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，批號分別為B161201，B161202，B161203）；甲醇（色譜純，批號為164488，純度為 99．9% ），乙腈（色譜純，批號為1606018，純度為99．9%），均購于賽默飛世爾科技有限公司；甲醇（分析純，批號為20151216，國藥集團化學試劑有限公司，純度不低于99．5%）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent SB －C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0．4% 磷酸（10 ∶90）；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；流速：1 mL／min。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于3 000。

2．2 溶液制備

對照品溶液：取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取 1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，棄初濾液，取續(xù)濾液，再用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，即得。

陰性對照品溶液：取按樣品制備工藝制備的缺金銀花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：取 2．2項下 3種溶液各 10 μL，進樣測定。結(jié)果陰性對照品溶液在對照品溶液及供試品溶液色譜峰相應位置無綠原酸峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾，表明專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含綠原酸0．07 mg的溶液，搖勻，作為對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液2，4，6，8，10，14 μL，按擬訂色譜條件進行分析，測定峰面積。以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝2×106X －10 383，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，綠原酸進樣量在 0．14 ～ 0．98 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次。結(jié)果綠原酸面積的 RSD為0．29%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，16 h時進樣測定。結(jié)果綠原酸含量的 RSD為0．28%（n＝5），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為B161201）樣品5份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果綠原酸平均含量為每片 1．55 mg，RSD 為 1．60%（n＝5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取6份已知含量的樣品（批號為 B161201）約 0．5 g，分別加入綠原酸對照品溶液0．8，1．0，1．2 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取清熱解毒分散片3批，依法檢測。結(jié)果批號分別為B161201，B161202，B161203的3批樣品中綠原酸含量分別為每片 1．55，1．57，1．64 mg。

3 討論

3．1 色譜柱選擇

曾選擇3種不同廠家的色譜柱Agilent SB－C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），YMC －ODS 分析柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Phenomenex－ C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm），考察了方法的耐用性，分離度、理論板數(shù)均能滿足系統(tǒng)適用性試驗的要求。綜合對稱因子等各種因素，選擇 Agilent SB － C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）為色譜柱。

3．2 檢測波長選擇

對綠原酸進行紫外掃描（200～600 nm），發(fā)現(xiàn)綠原酸在327 nm波長處有最大吸收，且吸收強度適宜，其他組分響應值相對較小，結(jié)合文獻[6－7]，選擇327 nm作為檢測波長。

3．3 流動相選擇

綠原酸為含有羥基和鄰二酚羥基的強極性有機酸[8]，溶于水后有部分解離，容易發(fā)生主峰拖尾、重復性差等現(xiàn)象，因此需在流動相中加入一定比例的酸，能抑制酸解離，有助于提高主峰與干擾峰的分離度，改善峰形[9－10]。試驗選用甲醇 －水 －甲酸（30∶70 ∶0．2）和乙腈 －0．4%磷酸（10∶90）為流動相，對流動相不同組分和比例進行調(diào)節(jié)，讓其能排除其他成分的干擾，綠原酸保留時間和峰形都適宜，最后選定流動相為乙腈－0．4%磷酸(10∶90)。

3．4 提取溶劑選擇

綠原酸易溶于醇、水，難溶于氯仿、乙醚。試驗分別考察乙醇、甲醇、50%甲醇提取溶劑，超聲提取、加熱回流提取方法及20，30，40 min超聲提取時間對結(jié)果的影響，結(jié)果30 min后測定值達到穩(wěn)定值，超聲提取和回流提取所提取出的綠原酸含量結(jié)果非常接近，但超聲提取比回流提取更簡便快捷。由于樣品溶液中成分相對復雜，用50%甲醇方法提取效果較好，提取比較完全，而且雜質(zhì)峰相對較少。故基于操作簡便等各方面考慮，以50%甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min即可[11－12]。

3．5 質(zhì)控指標選擇

清熱解毒分散片是一種新型現(xiàn)代化中藥劑型，2015年版《中國藥典（一部）》收載了清熱解毒口服液和清熱解毒片，清熱解毒口服液質(zhì)量標準對黃芩苷進行了含量測定[5]1552，清熱解毒片質(zhì)量標準對黃芩苷和梔子苷2種成分進行了含量測定[5]1553，但未對組方中的其他組分進行含量測定?？紤]到清熱解毒分散片方中金銀花的用量和功效遠遠高于黃芩和梔子，綠原酸為金銀花中的主要活性成分之一，對綠原酸含量的測定能直接反映藥品質(zhì)量，確保療效，控制產(chǎn)品質(zhì)量。且不同廠家生產(chǎn)的品種中綠原酸的含量會存在一定差異，故本試驗以綠原酸為質(zhì)控指標[13－15]。