劉亞舉 ，郭利紅 ，李 瑾，岳俊濤 ，石美森

（1.許昌市公安局刑事科學技術(shù)研究所，河南 許昌 461000；2.河南省公安廳刑事科學技術(shù)研究所，河南鄭州 450003；3.中國政法大學 證據(jù)科學教育部重點實驗室，北京 100088）

Y染色體短串聯(lián)重復序列（Y-chromosome short tandem repeats，Y-STR）在減數(shù)分裂過程中不發(fā)生重組，呈穩(wěn)定的單倍型父系遺傳，且序列的改變僅僅是由突變引起，較常染色體STR基因座具有顯著的人群及地域分布特征。因此，選擇多個Y-STR基因座構(gòu)建合適的復合擴增體系，探討其單倍型在不同人群中的分布規(guī)律，在人類的起源進化、群體劃分、種族民族差異和法醫(yī)學領(lǐng)域等研究中具有極其重要的意義。

STRtyper-27Y擴增熒光檢測試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司）的27個Y-STR基因座能夠區(qū)分來源于多群體不同家系男性之間的父系親屬關(guān)系，可以增加近親男性的個體識別度[1-4]。本研究采用STRtyper-27Y擴增熒光檢測試劑盒[5-9]對甘肅東鄉(xiāng)族男性人群中的遺傳多態(tài)性進行調(diào)查，旨在為個體識別和父權(quán)鑒定提供基礎群體數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

根據(jù)知情同意原則，從健康體檢人群中隨機采集526名甘肅省臨夏回族自治州東鄉(xiāng)族自治縣東鄉(xiāng)族無關(guān)男性個體外周血0.1mL，滴入采血卡（武漢驥騰公司），陰干后常溫保存。該研究得到相關(guān)道德倫理委員會批準。

通過YHRD數(shù)據(jù)庫（www.yhrd.org）獲得中國漢族（YA004092）、河南漢族（YA004057）、廣東漢族（YA004066）、甘肅藏族（YA004043）、丹麥（YA003283）、德 國 （YA003473）、意 大 利 （YA003983）、西 班 牙（YA003147）、波蘭（YA003124）、瑞士（YA003269）、美國亞洲裔（YA004084）、美國拉美裔（YA004086）、美國歐洲裔（YA004085）、美國非洲裔（YA004083）共14個群體的27個Y-STR基因座（DYS576、DYS389Ⅰ、DYS635、DYS389Ⅱ、DYS627、DYS460、DYS458、DYS19、GATA_H4、DYS448、DYS391、DYS456、DYS390、DYS438、DYS392、DYS518、DYS570、DYS437、DYS385a/b、DYS449、DYS393、DYS439、DYS481、DYF387S1a/b、DYS533）單倍型分布數(shù)據(jù)（共 6 322 個單倍型）。

1.2 方法

根據(jù)STRtyper-27Y擴增熒光檢測試劑盒說明書，用直接擴增法（免提?。η笆鲅獦樱?.2 mm直徑血卡）進行PCR擴增。在9700型PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行復合擴增，反應體系為 10 μL，其中 PCR Master Mix 5.0 μL、Primer Mix 2.5μL、純水 2.5μL。 PCR 條件：95℃ 5min；94℃ 10s，61℃ 1 min，70℃ 30 s，28 個循環(huán)；60℃ 20 min；4℃保溫。取1μL擴增產(chǎn)物與0.5μL熒光標記內(nèi)標SIZE-500 Plus和8.5μL去離子甲酰胺混合，95℃變性3min后，冰浴3min，置3500xL基因分析儀（美國AB公司）上全自動毛細管電泳，Data Collection軟件收集數(shù)據(jù)，用GeneMapper?ID-X v1.4軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行等位基因分型。每批樣本檢測均采用007和超純水分別作為陽性對照和陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用直接計數(shù)法對各基因座的等位基因頻率和單倍型檢出頻率進行計算?；蚨鄻有裕╣ene diversity，GD）和單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）采用公式：

其中Pi為等位基因或單倍型頻率，n為樣本數(shù)。利用YHRD數(shù)據(jù)庫提供的在線工具（http://www.yhrd.org/Analyse/AMOVA）進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA），計算臨夏回族自治州東鄉(xiāng)族自治縣東鄉(xiāng)族無關(guān)男性群體與其他14個群體間的遺傳距離（Rst值），并構(gòu)建多維尺度分析圖（multidimensional scaling，MDS）。

2 結(jié) 果

2.1 甘肅東鄉(xiāng)族人群27個Y-STR基因座遺傳多態(tài)性

27個Y-STR基因座在526名甘肅東鄉(xiāng)族無關(guān)男性個體中均得到了有效擴增，且各基因座間擴增產(chǎn)物平衡，擴增片段長度在100～500bp。27個Y-STR基因座的等位基因頻率見表1。在23個單拷貝基因座中共檢測到196個等位基因，各基因座分別檢出4～16個等位基因，等位基因頻率為0.001 9～0.707 2，在DYS448、DYS533、DYS19、GATA_H4、DYS456、DYS570基因座觀察到了等位基因缺失現(xiàn)象。雙拷貝基因座DYS385a/b共觀察到17個等位基因，55種單倍型；DYF387S1a/b檢出10個等位基因，39種單倍型。

27個Y-STR基因座共檢出471種單倍型，累積GD值達0.9995，詳見表2，其中GD值最低為DYS391（0.4539），最高為 DYS385a/b（0.9575）。7 個快速突變基因座（DYS576、DYS627、DYS570、DYS518、DYS449、DYF387S1a/b）的GD值均在0.7以上。

2.2 甘肅東鄉(xiāng)族與參考群體間的遺傳距離及MDS分析

應用本研究甘肅東鄉(xiāng)族人群27個Y-STR基因座單倍型數(shù)據(jù)，計算與YHRD數(shù)據(jù)庫中其他14個群體相同基因座的遺傳距離（表3）。結(jié)果表明，甘肅東鄉(xiāng)族與其他14個群體之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在亞洲群體中，甘肅東鄉(xiāng)族與甘肅藏族之間的遺傳距離最近（0.068 2），其次是與廣東漢族（0.073 4）、美國亞洲裔（0.063 0）之間的遺傳距離較近，與河南漢族之間的遺傳距離相對最遠（0.084 7）?；谶z傳距離所構(gòu)建的MDS基本與之相符，其中甘肅東鄉(xiāng)族和甘肅藏族群體聚為一大類（圖1）。

表1 27個Y-STR基因座的等位基因頻率 （n=526）

表1（續(xù)）

表2 27個Y-STR基因座的GD值 （n=526）

國美 國美裔美拉 裔洲歐＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋1 0.025國美裔洲亞＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋5 0.178 9 0.095）值ts R是下線角對，值P的應對是上線角對（陣矩離距傳遺值ts R體群個41他其與族鄉(xiāng)東肅甘3表國美裔洲非＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋5 0.170 9 0.249 4 0.159人士瑞＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋3 0.197 8 0.155 2 0.008 6 0.020人牙班西 人蘭波 人利大意 人國德 人麥丹肅族甘藏＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－1 0.134＋＋＋0 0.007 5 0.113＋ ＋9 0.053 1 0.049 5 0.120＋9 0.175 4 0.057 6 0.109 4 0.150 7 0.250 5 0.047 8 0.094 2 0.099 8 0.177 1 0.036 8 0.194 4 0.031 6 0.043 1 0.027 2 0.154 1 0.264 1 0.212 1 0.154 8 0.167 2 0.167 9 0.154 2 0.168 9 0.230 5 0.094 4 0.147 6 0.170 0 0.086 3 0.012 4 0.227 9 0.038 5 0.066 4 0.056 5 0.189 8 0.031 2 0.178 8 0.008 0 0.051 4 0.048 9 0.125南河 東廣族漢 族漢＋ ＋＋ ＋＋5 0.022 8 0.083 3 0.091 5 0.187 3 0.181 9 0.165 8 0.165 6 0.117 6 0.114 0 0.220 3 0.231 0 0.175 6 0.185 2 0.185 4 0.173 3 0.202 2 0.173 2 0.023 4 0.007 6 0.191 9 0.192 9 0.128 6 0.118國中族漢＋0 0.010 3 0.010 9 0.091 6 0.183 1 0.166 6 0.112 2 0.237 0 0.177 9 0.174 9 0.202 1 0.012 3 0.185 0 0.121肅甘族鄉(xiāng)東族3 0.077 4 0.073 7 0.084 2 0.068 7 0.065 9 0.044 6 0.052 5 0.089 7 0.131 0 0.093 6 0.119裔0 0.063裔5 0.121裔5 0.067裔0.05

3 討 論

本研究中，27個Y-STR基因座共檢出471種單倍型，累積GD值達0.9995。其中檢出單倍型最多的是DYS385a/b基因座（55種），DYF387S1a/b基因座次之（39種），其余23個單拷貝基因座中共檢測到196個等位基因，各基因座分別檢出4～16個等位基因。結(jié)果表明，27個Y-STR基因座可用于家系排查及數(shù)據(jù)庫建設。

遺傳距離為表示群體間或物種間遺傳差異或遺傳分化的最重要參數(shù)，是以兩個群體間同一座位上相同等位基因頻率差異的函數(shù)為測定依據(jù)的。本研究構(gòu)建的Rst遺傳距離矩陣顯示，甘肅東鄉(xiāng)族與甘肅藏族之間的遺傳距離最近。從MDS的散點圖結(jié)果可以看出，15個群體大致可以劃分為4個類群：第一類群，甘肅東鄉(xiāng)族、甘肅藏族、美國非洲裔；第二類群，中國漢族、廣東漢族、河南漢族、美國亞洲裔；第三類群，丹麥、德國、波蘭；第四類群，西班牙、美國歐洲裔、美國拉美裔、意大利、瑞士。大體上看，27個Y-STR基因座組成的單倍型計算的遺傳距離結(jié)果與各參考群體地域分布較一致[10]，表明Y染色體遺傳標記在種族、民族群體間遺傳距離和基因漂流的評價中起到了重要作用。

綜上，本研究獲得了甘肅東鄉(xiāng)族群體27個Y-STR基因座的等位基因頻率及單倍型分布數(shù)據(jù)，為建立甘肅東鄉(xiāng)族群體Y-STR分布數(shù)據(jù)庫、該地區(qū)法醫(yī)學應用及遺傳關(guān)系的分析提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)。