喬 毅，沈 輝，萬(wàn)夕和，王李寶，史文軍，黎 慧，蔣 葛，范賢平，張建明

( 1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007； 2.江蘇省海洋漁業(yè)指揮部，江蘇 南通 226006 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所的魚(yú)類(lèi)育種專(zhuān)家于1976—1981年成功選育的一種鯽魚(yú)養(yǎng)殖新種，因其具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為我國(guó)重要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。近些年，隨著異育銀鯽養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，養(yǎng)殖戶不斷提高放養(yǎng)密度，投喂高蛋白優(yōu)質(zhì)餌料，獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益。但是在追求高產(chǎn)的同時(shí)，異育銀鯽的病害頻頻爆發(fā)，鰓出血病[1-3]、黏孢子蟲(chóng)病[4]和常見(jiàn)細(xì)菌病害[5-7]給該產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失，嚴(yán)重制約異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬弧菌科，氣單胞菌屬，廣泛分布于自然界的各種水體中，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌[8-9]，為條件致病菌，也是典型的人—獸—漁共患病病原菌[10]。目前在淡水養(yǎng)殖過(guò)程中，大多數(shù)品種均有嗜水氣單胞菌引起病害的報(bào)道，其主要癥狀是爆發(fā)性出血，由于嗜水氣單胞菌的血清型較多，所以感染不同對(duì)象表現(xiàn)的癥狀各異。目前，以抗菌藥物治療水生動(dòng)物細(xì)菌性病害是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中最常用的方法，由于抗菌藥物的長(zhǎng)時(shí)間亂用和濫用，水產(chǎn)病原菌在應(yīng)對(duì)藥物反復(fù)刺激的壓力下形成的耐藥性日趨嚴(yán)重，使得水產(chǎn)源病原菌引起的疾病藥物治療效果越來(lái)越差?；前奉?lèi)藥物因其具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、吸收迅速、使用方便和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)的抗菌藥物之一，磺胺類(lèi)藥物通過(guò)阻礙細(xì)菌RNA的合成達(dá)到抑菌作用，可防治多種水產(chǎn)病原菌，而臨床中的不合理使用，使得該類(lèi)藥物的耐藥性日益突顯。

江蘇省蘇北地區(qū)異育銀鯽養(yǎng)殖面積超過(guò)六萬(wàn)公頃，近些年病害引起該地區(qū)異育銀鯽的損失高達(dá)十余億元。2015年，本課題研究團(tuán)隊(duì)從鹽城市大豐地區(qū)異育銀鯽病樣中篩選致病菌株，經(jīng)鑒定其中嗜水氣單胞菌36株。筆者以分離純化的嗜水氣單胞菌為對(duì)象，分析菌株對(duì)磺胺類(lèi)藥物的敏感性，同時(shí)對(duì)菌株攜帶的磺胺類(lèi)耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，旨在為臨床用藥以及嗜水氣單胞菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制作一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

36株嗜水氣單胞菌株，為2015年3—9月大豐發(fā)病異育銀鯽體內(nèi)分離得到，依次編號(hào)為1、2、3、……、36；嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966購(gòu)自蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 主要試劑

磺胺嘧啶(CAS：68-35-9)、磺胺甲噁唑(CAS：723-46-6)、磺胺異噁唑(CAS：127-69-5)、磺胺二甲基嘧啶(CAS：57-68-1)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁芎退饫业鞍篆傊囵B(yǎng)基購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Agarose B、Low EEO、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DEPC水購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、T-Vector pMDTM19 (Simple)、Ribonuclease A (RNase A)等分子生物試劑購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；藥敏紙片自制，含量均為300 μg/片；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 菌株藥物敏感性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，接種低溫凍存的菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇細(xì)菌。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法，挑取純培養(yǎng)菌落，懸于3 mL的無(wú)菌生理鹽水試管中，混勻后調(diào)整濁度與0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁芤恢隆Ｓ脽o(wú)菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布整個(gè)水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基表面。待平板上的水分被瓊脂完全吸收后，用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片貼上后不可再拿起，用鑷子輕壓紙片中央，保證紙片與瓊脂表面緊密貼合，每張紙片中心間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，在細(xì)菌接種后15 min內(nèi)貼完紙片。將平板倒置，28 ℃培養(yǎng)18～20 h，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈直徑。參照標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果(表1)。每批藥敏試驗(yàn)必須用大腸桿菌ATCC25922做質(zhì)控。只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)，其他菌株的結(jié)果才可以報(bào)告。

1.4 Sul基因擴(kuò)增及分析

按照天根試劑盒操作說(shuō)明分別提取嗜水氣單胞菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA，經(jīng)RNase A酶去除DNA制備過(guò)程中的RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。磺胺?lèi)藥物耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3引物參照文獻(xiàn)[11]的報(bào)道(表2)。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。分別以嗜水氣單胞菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增磺胺類(lèi)耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3。擴(kuò)增采用50 μL體系，包括25 μL Premix Taq酶，上、下游引物各2 μL，DEPC處理水19 μL，模板2 μL。3個(gè)基因的擴(kuò)增程序一致：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)出現(xiàn)與目的片段大小相符的條帶進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物按操作說(shuō)明與pMDTM19 載體連接后導(dǎo)入工程菌DH5α 中構(gòu)建重組質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒DNA用相應(yīng)基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增陽(yáng)性的質(zhì)粒外送測(cè)序。序列結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列間相似性分析，再通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因庫(kù)中Blast比對(duì)，并利用Clustal X 3.0和Mega 6.0軟件構(gòu)建耐藥基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用紙片擴(kuò)散法和肉湯稀釋法測(cè)定36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對(duì)4種磺胺類(lèi)藥物敏感性，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，以紙片周?chē)纬傻囊志Υ笮∽鳛樵u(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌藥物敏感性的主要依據(jù)，結(jié)合描述的方法，在進(jìn)行藥物敏感性的最終判定時(shí)，對(duì)紙片法顯示為中介而最小抑菌質(zhì)量濃度值較大的菌株判定為耐藥，對(duì)抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而最小抑菌質(zhì)量濃度值偏大的菌株判定為敏感。其藥物敏感性結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 磺胺類(lèi)耐藥基因擴(kuò)增引物

表3 嗜水氣單胞菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：R，耐藥；I，中介；S，敏感；MIC，最小抑菌質(zhì)量濃度.

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，36株嗜水氣單胞菌對(duì)磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺異噁唑和磺胺甲噁唑的耐藥率分別為83.34%、72.22%、66.66%和69.45%，其具體耐藥菌株號(hào)見(jiàn)表4。

表4 嗜水氣單胞菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥率、中介率和敏感率

2.2 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

本研究通過(guò)常規(guī)PCR方法對(duì)36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類(lèi)藥物耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，其電泳結(jié)果見(jiàn)圖1～圖6，其中Sul1耐藥基因在細(xì)菌染色體中檢測(cè)為陽(yáng)性的有11株，質(zhì)粒中陽(yáng)性的有10株；Sul2耐藥基因在細(xì)菌染色體中檢測(cè)為陽(yáng)性的有30株，質(zhì)粒中陽(yáng)性的有33株；Sul3耐藥基因在36株菌的染色體和質(zhì)粒中均未檢出。

圖1 染色體Sul1耐藥基因電泳結(jié)果

圖2 質(zhì)粒Sul1耐藥基因電泳結(jié)果

圖3 染色體Sul2耐藥基因電泳結(jié)果

圖4 質(zhì)粒Sul2耐藥基因電泳結(jié)果

圖5 染色體Sul3耐藥基因電泳結(jié)果

圖6 質(zhì)粒Sul3耐藥基因電泳結(jié)果

分別統(tǒng)計(jì)對(duì)4種磺胺類(lèi)藥物耐藥的嗜水氣單胞菌中耐藥基因的攜帶情況(表6)，Sul1耐藥基因在4種藥物耐藥菌的染色體和質(zhì)粒上攜帶率顯著；Sul2耐藥基因在4種藥物耐藥菌的染色體上攜帶率為83.33%～88.00%，在質(zhì)粒上攜帶率為91.67%～93.33%。

2.3 基因克隆及分析

耐藥基因電泳結(jié)果除具有目的片段大小的條帶外還有其他非特異擴(kuò)增(圖1～圖4)，本研究將目的片段大小的條帶進(jìn)行切膠回收，通過(guò)克隆后外送測(cè)序。序列大小與預(yù)期結(jié)果基本相符，通過(guò)DNAMAN軟件分別對(duì)Sul1和Sul2基因片段進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示序列一致性為100%。將序列輸入美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，Sul1和Sul2基因序列分別與數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)基因片段同源性達(dá)到100%。

在GenBank分別下載多個(gè)Sul1和Sul2基因，通過(guò)Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，本研究中的嗜水氣單胞菌磺胺類(lèi)藥物耐藥基因Sul1與不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，登錄號(hào)：EU375649.1)的Sul1基因聚為一支(圖7)；Sul2耐藥基因與假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas，登錄號(hào)：EF492006.1)的Sul2基因聚為一支(圖8)。

表5 嗜水氣單胞菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

注：“+”示結(jié)果陽(yáng)性，但條帶較弱；“++”示結(jié)果陽(yáng)性，條帶較亮；“-”示結(jié)果陰性.

表6 磺胺類(lèi)藥物耐藥嗜水氣單胞菌染色體和質(zhì)粒上耐藥基因的攜帶率

圖7 嗜水氣單胞菌Sul1耐藥基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖8 嗜水氣單胞菌Sul2耐藥基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

采用紙片擴(kuò)散法和最小抑菌質(zhì)量濃度法測(cè)試了36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對(duì)4種磺胺類(lèi)藥物的敏感性，2種方法的試驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，為了能準(zhǔn)確反映細(xì)菌的藥物敏感性，結(jié)果參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行判定，以紙片擴(kuò)散法抑菌圈的大小作為主要依據(jù)，輔以最小抑菌質(zhì)量濃度評(píng)價(jià)藥物敏感性，對(duì)于紙片法中介，最小抑菌質(zhì)量濃度值較大的菌株判定為耐藥，對(duì)于抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而最小抑菌質(zhì)量濃度值偏大的菌株判定敏感。試驗(yàn)中最小抑菌質(zhì)量濃度法的肉湯中磺胺類(lèi)藥物配制的最高質(zhì)量濃度為512 μg/mL，當(dāng)最高質(zhì)量濃度的試管中依然有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)最小抑菌質(zhì)量濃度值記為>512 μg/mL。最終試驗(yàn)結(jié)果表明36株菌對(duì)磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺異噁唑耐藥率依次為83.34%、72.22%、66.66%和69.45%，這與彭彬等[13-16]的研究結(jié)論相似，由此可見(jiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖源嗜水氣單胞菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐性達(dá)到非常嚴(yán)重的水平。

對(duì)磺胺類(lèi)藥物敏感的細(xì)菌不能直接利用周?chē)h(huán)境中的葉酸，只能利用氨苯甲酸和二氫蝶啶在細(xì)菌體內(nèi)經(jīng)二氫葉酸合成酶的催化合成二氫葉酸，再經(jīng)過(guò)二氫葉酸還原酶的作用形成四氫葉酸。四氫葉酸的活化型是一碳單位的傳遞體，在嘌呤和嘧啶核苷酸形成過(guò)程中起著重要的傳遞作用?；前奉?lèi)藥物的結(jié)構(gòu)跟氨苯甲酸相似，因而可與氨苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，阻礙二氫葉酸的合成，從而影響核酸的合成，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。細(xì)菌額外獲得二氫葉酸合成酶(Sul基因編碼)和二氫葉酸還原酶(dfrA基因編碼)編碼基因，降低了磺胺類(lèi)藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)補(bǔ)充了二氫葉酸還原酶，削弱磺胺類(lèi)藥物增效劑(如甲氧芐啶等)的作用，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物出現(xiàn)耐藥[17]。其中Sul基因在細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐藥過(guò)程中起主要作用，目前認(rèn)為Sul基因可以分為3個(gè)亞型，分別為Sul1[18]、Sul2[19]和Sul3[20]，其中Sul1基因由Ⅰ類(lèi)整合子介導(dǎo)，可在不同菌株間水平傳播，Sul2基因既可存在大的質(zhì)粒上又可由染色體介導(dǎo)，Sul3是Perreten等[20]在大腸桿菌中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Sul基因。本研究中在36株嗜水氣單胞菌的染色體和質(zhì)粒中均檢測(cè)到Sul1和Sul2基因，Sul1基因在染色體和質(zhì)粒中的檢出率分別為30.56%和25.64%，Sul2基因在染色體和質(zhì)粒中的檢出率分別為83.33%和91.67%，Sul3基因在染色體和質(zhì)粒中均未檢出,并且在對(duì)4種磺胺類(lèi)藥物耐藥嗜水氣單胞菌染色體和質(zhì)粒中都有較高的攜帶率，可見(jiàn)Sul1和Sul2耐藥基因與36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類(lèi)藥物耐藥性存在相關(guān)性，其中Sul2可能是介導(dǎo)耐藥的重要基因。該結(jié)果與羊云飛等[21]的研究較為相似，賴海梅等[22]在肉雞沙門(mén)氏菌(Salmonella)中檢測(cè)到Sul1、Sul2和Sul3的陽(yáng)性率分別為40%、100%和63.3%，認(rèn)為Sul2是主要的磺胺類(lèi)耐藥基因，而與Antunes等[23-25]Sul1為磺胺類(lèi)藥物的主要耐藥基因的研究結(jié)果存在差異。Huerta等[26-27]研究認(rèn)為耐藥基因的產(chǎn)生很有可能是多因子共同影響的結(jié)果，Ji等[28]就發(fā)現(xiàn)Sul1和Sul3與重金屬Cu、Zn和Hg存在顯著正相關(guān)，本研究的對(duì)象、時(shí)間和空間的差異可能是導(dǎo)致與其他學(xué)者研究結(jié)果不同的因素。Hoa等[29]研究表明，大多數(shù)Sul基因位于染色體基因上，本研究對(duì)嗜水氣單胞菌磺胺類(lèi)耐藥基因在染色體DNA和質(zhì)粒DNA上分布情況做了簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sul基因在嗜水氣單胞菌的染色體和質(zhì)粒DNA上分布差異不顯著，這與王娜[30]的研究結(jié)論一致?；前奉?lèi)耐藥性與耐藥基因及其分布關(guān)系復(fù)雜，是開(kāi)展深入研究的一個(gè)重要方向。

通過(guò)對(duì)36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類(lèi)藥物的敏感性研究，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的抗性較強(qiáng)，對(duì)該類(lèi)細(xì)菌引起的水生動(dòng)物病害控制形成一定難度。同時(shí)，嗜水氣單胞菌是一種人—獸—漁共患病菌，這對(duì)人類(lèi)公共衛(wèi)生、食品安全和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅。另外，耐藥基因能夠通過(guò)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件上在同種或不同種細(xì)菌間水平傳播，因此，關(guān)于該地區(qū)異育銀鯽源嗜水氣單胞菌耐藥基因的研究應(yīng)該受到廣泛關(guān)注。