武潑潑 張學杰 張洛艷 樊守金

(山東師范大學生命科學學院逆境植物重點實驗室，濟南 250014)

禾本科(Poaceae)植物種類眾多，全世界約有700個屬、10 000多種，起源時間最早可以追溯到約7 000年前的白堊紀(Cretaceous)[1]，從溫帶氣候為主的環(huán)境逐漸適應如今多種多樣的生態(tài)環(huán)境，分布區(qū)覆蓋地球陸地面積的五分之一[2]。短柄草族隸屬于禾本科早熟禾亞科(Pooideae),全球約16種，主要分布在歐洲和亞洲大陸的溫帶地區(qū)，亞洲的高山以及從墨西哥到玻利維亞的美洲地區(qū)亦有分布[3]，我國分布有5種，其中兩種是中國特有。其總狀花序和雀麥族的圓錐花序共同演化形成小麥族的穗狀花序[4]，和小麥族有著較近的親緣關(guān)系。

該族植物具有重要經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和科研價值。Bossolini等提出將短柄草和二穗短柄草作為模式植物，作為小麥(Triticumaestivum)和水稻(Oryzasativa)研究的橋梁[5]。短柄草是短柄草族多年生草本植物，優(yōu)良牧草，分蘗能力強，水土保持能力良好。Steinwand等將短柄草開發(fā)為研究多年生禾草的模式植物[6]。二穗短柄草是短柄草族一年生草本植物,具有植株小，生長周期短，且染色體基因組小，結(jié)構(gòu)也較為簡單，較易遺傳轉(zhuǎn)化等特點，被開發(fā)為研究小麥、大麥(Hordeumvulgare)等麥類作物的模式植物。二穗短柄草基因組測序已經(jīng)完成，基因組共5條染色體，測序獲得拼接總長為272 MB的序列框架圖，約包含25 532個編碼基因[7]。根據(jù)測序結(jié)果，二穗短柄草與小麥基因組相似度很高，親緣關(guān)系很近。以二穗短柄草為模式材料研究麥類作物，具有較高的準確性和效率，為解析小麥抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等重要性狀提供了新的突破口。但是小麥族、雀麥族和短柄草族的系統(tǒng)學位置尚不明確。觀點主要分為3類：一類認為短柄草屬(Brachypodium)和雀麥族有較近的親緣關(guān)系[8～9]；一類支持短柄草屬歸屬于小麥族[10～13]；一類支持短柄草屬獨立成族[14～19]。短柄草族植物在我國主要分布于喜馬拉雅山脈和橫斷山脈交界處，對揭示青藏高原的隆起和闡明植物的分布原因具有重要研究價值。因此，對短柄草族植物展開系統(tǒng)學和生物地理學研究是很有必要的。

核糖體rDNA片段ITS位于核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)，是目前生物系統(tǒng)發(fā)育進化分析和DNA Barcoding研究中廣泛應用的核基因片段。Alvarez&Wendel對發(fā)表在在幾個著名的系統(tǒng)學和進化學期刊中的植物系統(tǒng)發(fā)育文章進行調(diào)查統(tǒng)計[20]，共計調(diào)查244篇文獻，在屬及屬下水平研究中涉及nrITS序列的文獻占三分之二(66%)，超過三分之一(34%)的系統(tǒng)發(fā)育樹是只依靠nrITS序列進行構(gòu)建的。

葉綠體基因psbA-trnH是一段非編碼序列，長度約為450 bp，進化速率較快，且序列兩端保守，有利于通用引物的設計，是目前常用的DNA Barcoding候選片段之一[21]。Li等人對植物條形碼的研究綜述中也表明psbA-trnH是目前應用最廣泛的質(zhì)體DNA條形碼[22]。

單拷貝基因由于含有更多的遺傳信息，逐漸受到分類學家的廣泛重視[23～24]。DMC1是減數(shù)分裂相關(guān)的單拷貝核基因，在多倍體中獨立遺傳，在小麥族的多倍體體形成、屬的分類研究中得到廣泛應用。Tang等利用DMC1片段對四倍體小麥A基因組的起源進行研究。表明小麥A基因組來自于Triticumurartu，而不是一粒小麥(T.monococcum)[25]。

因此，本研究用葉綠體基因片段psbA-trnH，核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS，單拷貝核基因片段DMC1以及psbA-trnH+nrITS+DMC1聯(lián)合序列對短柄草族及其相關(guān)屬進行研究，以期為其系統(tǒng)學位置、屬下關(guān)系和分歧時間提供翔實的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究共選取36份材料，其中短柄草屬3種7個個體、雀麥屬5種、小麥族7屬23種，并選稻亞科(Oryzoideae)的稻為外類群。憑證標本均保存于山東師范大學標本館(SDNU)，相關(guān)信息見表1?；贏rcGIS軟件制作的采集地點分布圖見圖1。

表1 實驗材料及其來源Table 1 List of plant materials used in this study and their original resources

圖1 標本采集地點分布圖Fig.1 The distribution of sampling locations

1.2 DNA提取與PCR擴增

DNA材料來自于硅膠快速干燥保存的葉片，用改良的CTAB法[26]和DNA試劑盒提取DNA。擴增引物序列見表2。nrITS反應程序：95℃ 4 min；35個循環(huán)，分別為94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s；最后72℃延伸10 min。psbA-trnH反應程序：94℃ 3 min；30個循環(huán)，分別為94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；最后72℃延伸10 min。DMC1反應程序：94℃ 5 min；35個循環(huán)，分別為94℃ 60 s，52℃ 60 s，72℃ 60 s；最后72℃延伸8 min。擴增反應在Bio-Rad T100 PCR儀上進行，PCR反應體系為20 μL：2*Taq PCR Master Mix(萊楓，上海)10 μL，上游和下游引物(華大，北京)各1 μL，DNA模板1 μL，7 μL ddH2O。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后交于北京華大基因公司測序。

表2 PCR引物名稱及序列Table 2 The names and sequences of Primers

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Clustal X 1.8.3對目的序列進行比對分析，空位(Gap)做缺失處理，利用Gblocks 0.91b對基因序列進行剪切，手工調(diào)整完成校對。利用SquenceMatrix將Gblock得到的基因序列聯(lián)合。通過Shortcut to DAMBE進行核酸飽和性檢驗，檢驗序列是否適合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用軟件MrModeltest選擇最佳核苷酸替換模型，ITS最佳模型為GTR+G，psbA-trnH最佳模型為HKY+I+G，DMC1最佳模型為HKY+G，聯(lián)合序列在nex文件分區(qū)，模型對應如上。分別用MEGA6、PAUP 4.0、MrBayes 3.2.6進行最大簡約法(MP)分析、最大似然法(ML)分析和貝葉斯法(BI)分析，構(gòu)建3種進化樹。采用啟發(fā)式搜索對四組數(shù)據(jù)進行1 000次隨機重復檢驗，TBR置換算法，得到的自展支持率用于評價最大似然樹和最大簡約樹的拓撲結(jié)構(gòu)的可靠性。使用MrBayes 3.2.6進行貝葉斯推理法分析，替換模型采用MrModeltest的結(jié)果，位點間差異比率采用γ分布比率差異，其中部分為不變位點，其余參數(shù)為默認值，采用馬爾科夫—蒙特卡羅鏈數(shù)據(jù)模擬估算后驗概率，數(shù)據(jù)運行1 000 000代，取樣頻率為1 000，總結(jié)樹前舍棄25%老化樣本，計算最優(yōu)分支格局獲得發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)，以后驗概率作為評估參數(shù)。

1.4 分化時間計算

用BEAST v1.8.4[27]進行分化時間計算。首先對聯(lián)合序列進行似然比檢驗LRT(likelihood ratio test)確定該片段在各進化枝中是符合嚴格分子鐘還是寬松分子鐘。利用BEAST1.8.4中的寬松分子鐘模型估算系統(tǒng)發(fā)育樹上的每個節(jié)點的分歧時間。依據(jù)已有的化石記錄和分子鐘估計的時間選擇兩個節(jié)點進行標定：(1)選用稻亞科和早熟禾亞科的分歧時間49.6 Ma；(2)短柄草族和小麥族的分歧時間33 Ma。選擇“Yule”進化模型和GTR+G模型進行運算。四條馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo)迭代計算100 000 000代，每1 000代進行一次取樣，以保證參數(shù)posterior，prior和likelihood的有效取樣量(ESS)大于200。用軟件Tracer v1.6檢查收斂程度，最初的10 000代做為老化樣本舍去，用剩余樣本構(gòu)建時間尺度下的一致樹。用FigTree v1.4.2進行處理，得到各分支的分化時間。

1.5 生物地理學分析

植物區(qū)系主要根據(jù)區(qū)系組成和植被類型進行劃分，是一定區(qū)域內(nèi)所有植物種類的總和，是在一定的自然地理條件下發(fā)展演化的結(jié)果。根據(jù)吳征鎰的中國植物區(qū)系劃分方案，本研究所用材料可劃分為三個區(qū)域：A西北地區(qū)、B華北地區(qū)、C西南地區(qū)?；贐EAST1.8.4的trees文件，TreeAnnotator v1.8.4生成的tree文件以及統(tǒng)計的分布區(qū)信息，利用RASP(Reconstruct Ancestral State In Phylogenies)[28]軟件對短柄草族、雀麥族和小麥族進行祖先分布區(qū)重建。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于nrITS、DMC1和聯(lián)合序列構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹具有一致的拓撲結(jié)構(gòu)，稻為外類群，小麥族(Ⅰ)和雀麥族(Ⅱ)聚為一支互為姐妹群，短柄草族(Ⅲ)和這一支互為姐妹群?；趐sbA-trnH構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹，短柄草族單獨聚為一支，雀麥族散布鑲嵌在小麥族內(nèi)，共同聚為一支。系統(tǒng)發(fā)育圖如圖2，圖中支持率格式分別代表靴代值/后驗概率。在nrITS、DMC1、psbA-trnH和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的四個系統(tǒng)發(fā)育樹中，短柄草族的支持率都是100/100，高度支持該屬獨立成族。雀麥族在nrITS、DMC1和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中的支持率都是100/100，小麥族在nrITS、DMC1和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中的支持率分別是37/97，58/94，78/100，支持小麥族和雀麥族的成立，但是基于psbA-trnH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，雀麥族鑲嵌在小麥族內(nèi)，支持率為100/100，暗示小麥族和雀麥族有著多種進化歷史，可能發(fā)生過葉綠體基因的漸滲或轉(zhuǎn)移等事件。

圖2 小麥族、雀麥族和短柄草族系統(tǒng)發(fā)育圖 A.nrITS；B.psbA-trnH；C.DMC1；D.nrITS+psbA-trnH+DMC1 Ⅰ(小麥族)：節(jié)節(jié)麥、冰草、黑紫披堿草、加拿大披堿草、圓柱披堿草、披堿草、垂穗披堿草、老芒麥、麥薲草、Elymus tsukushiensis、布頓大麥草、短芒大麥草、球莖大麥、大麥、窄穎賴草、濱麥、大賴草、賴草、纖毛鵝觀草、黑麥、普通小麥、圓錐小麥；Ⅱ(雀麥族)：扁穗雀麥、雙雄雀麥、大麥狀雀麥、雀麥、旱雀麥；Ⅲ(短柄草族)：二穗短柄草、草地短柄草、短柄草Fig.2 The Phylogenetic tree of Triticeae, Bromeae and Brachypodieae A.nrITS；B.psbA-trnH；C.DMC1；D.nrITS+psbA-trnH+DMC1 Ⅰ(Triticeae)：Aegilops tauschii，Agropyron cristatum，Elymus atratus，Elymus canadensis，Elymus cylindricus，Elymus dahuricus，Elymus nutans，Elymus sibiricus，Elymus tangutorum，Elymus tsukushiensis，Hordeum bogdanii，Hordeum brevisubulatum，Hordeum bulbosum，Hordeum vulgare，Leymus angustus，Leymus mollis，Leymus racemosus，Leymus secalinus，Roegneria ciliaris，Secale cereale，Triticum aestivum，Triticum turgidum；Ⅱ(Bromeae)： Bromus catharticus，Bromus diandrus，Bromus hordeaceus，Bromus japonicus，Bromus tectorum；Ⅲ(Brachypodieae)：Brachypodium distachyum，Brachypodium pratense，Brachypodium sylvaticum

圖3 短柄草族、雀麥族和小麥族各分支分歧時間圖Fig.3 Divergence time of Brachypodieae,Bromeae and Triticeae

圖4 祖先分布區(qū)重建 A.西北地區(qū)；B.華北地區(qū)；C.西南地區(qū)Fig.4 The reconstruction of ancestral state A. Northwest region；B. North China；C. Southwest region

2.2 分化時間計算

經(jīng)LRT檢驗選用貝葉斯寬松分子鐘計算，利用多個標定點對聯(lián)合基因序列進行分析，這不僅能克服單個基因片段可能對分子鐘造成的偏離影響，還可以彌補因為單個基因片段信息量不足所造成的缺陷。短柄草族、雀麥族和小麥族各分支分歧時間結(jié)果如圖3所示。短柄草族其主要類群起源于33.16 Ma漸新世(Oligocene)的魯培勒階(Rupelian)，基部的二穗短柄草在8.08 Mya分化形成；雀麥族其主要類群起源于26.11 Mya的漸新世的恰特階(Chattian)，基部類群在14.17 Mya分化形成；小麥族主要類群起源于21.68 Mya的中新世(Miocene)早期，其基部類群在9.52 Mya分化形成。鑒于各地質(zhì)時間年齡值在不斷修訂，本研究的地質(zhì)時期名稱及其時間劃分來自于國際地層委員會(International Commission on Stratigraphy)在2017年2月更新的數(shù)據(jù)[29]。

2.3 祖先分布區(qū)重建

通過對短柄草族、雀麥族、和小麥族的祖先分布區(qū)重建，RASP結(jié)果如圖4。我國分布的短柄草族植物最近共同祖先分布在我國西南地區(qū)，小麥族和雀麥族組成小麥超族，最近共同祖先分布于我國西北地區(qū)。

3 討論

3.1 短柄草族系統(tǒng)學位置分析

本研究基于nrITS、DMC1、psbA-trnH及其聯(lián)合序列對短柄草族的系統(tǒng)學位置進行研究?；趎rITS、DMC1和聯(lián)合序列的結(jié)果高度支持短柄草屬成立短柄草族，這與Soreng[30～31]等人的結(jié)果相符合，也與Cheng等人[32]構(gòu)建的中國維管植物生命之樹相一致?；谌~綠體基因psbA-trnH的研究結(jié)果與其他基因片段及聯(lián)合序列結(jié)果沖突，表明小麥族與雀麥族有著復雜的進化路線，且二者親緣關(guān)系較近，支持小麥族和雀麥族組成小麥超族。綜合以上結(jié)果，短柄草屬單屬成族，且最先分化出來，位于基部；其次，雀麥族和小麥族分化形成，二者相互為姐妹群，二者有著復雜的進化路線。

3.2 短柄草族生物地理學分析

BEAST的分析結(jié)果顯示短柄草族位于三者的最基部，最先分化形成，分化時間是33.16 Ma，族下屬內(nèi)物種形成時間為二穗短柄草8.06 Ma，2.96 Ma短柄草與草地短柄草分化。在26.11 Ma雀麥族和小麥族開始分化，雀麥屬在26.11 Ma分化，賴草屬在21.68 Ma分化，大麥屬在20.16 Ma分化，冰草屬在20.16 Ma分化，披堿草屬在19.34 Ma分化，黑麥屬和小麥屬在15.68 Ma分化。結(jié)合地理地質(zhì)事件事件，青藏高原的隆升過程，可發(fā)現(xiàn)小麥族的屬下物種的形成大多集中在青藏高原的第三階段的隆升(7-13 Ma)，在此階段青藏高原在西北地區(qū)發(fā)生抬升事件[33]；短柄草族的物種形成時間在3 Ma之后，而青藏高原在3.6 Ma以來經(jīng)歷了地表強烈提升和高原快速擴張，同時期的東亞季風也在不斷加強[34]。中國特有種草地短柄草也是在此時間段分化形成。

祖先分布區(qū)重建結(jié)果也表明，小麥族與雀麥族祖先同屬于北方干旱地區(qū)，而短柄草族起源于濕潤的西南地區(qū)?，F(xiàn)如今，短柄草族的分布也主要集中在濕潤多雨區(qū)域，如喜馬拉雅山脈南側(cè)是海洋性氣候，分布較多；而山脈北側(cè)是大陸性氣候，該族物種分布較少。短柄草族植物的共同祖先是古地中海分布的，隨著古地中海的收縮退卻和喜馬拉雅山脈的隆起，中亞和西亞逐漸干旱[35]，部分短柄草屬植物退居在我國西南地區(qū)，西南地區(qū)的橫斷山脈在第四紀冰川時期也是多種生物的避難所?？梢酝茰y在古地中海收縮后，部分短柄草屬植物遷移到我國西南地區(qū)，在第四紀冰川時期，氣候的反復變化和青藏高原的隆起影響下形成現(xiàn)有分布格局。通過野外采集調(diào)查和網(wǎng)上資料收集，發(fā)現(xiàn)短柄草屬植物的分布和我國山脈水系走向密切相關(guān)，該屬植物主要分布在南北走向的橫斷山系和長江流域，東西走向的秦嶺和華南地區(qū)南北走向的山脈限制了該屬植物的擴張。

3.3 草地短柄草和短柄草進化關(guān)系

草地短柄草是我國特有種，但是與短柄草的關(guān)系一直存有疑問。在FOC被收錄，但外籍作者認為可能是短柄草的局部變體，The plantlist和GBIF皆未收錄。本研究的結(jié)果表明3個不同地區(qū)的短柄草聚成一支，3個不同地區(qū)的草地短柄草聚成一支，支持草地短柄草這一物種的成立。通過查看對比中科院北京植物研究所標本館和中科院西北高原生物研究所標本館以及iDigBio[36]公布的英國邱園、法國國家植物標本館、加利福尼亞科學院標本館、柏林達勒姆標本館、美國國家標本館、猶他州立大學植物標本館、密歇根大學標本館、密蘇里植物園標本館、北歐植物標本館、奧斯陸大學自然歷史博物館、亞利桑那州立大學維管植物標本館等標本館的實物標本和高清圖片，發(fā)現(xiàn)草地短柄草的具有小穗穗柄柄長大于2 mm的特點是該屬其他物種所不具有的。

短柄草屬植物全球廣布，其屬下15～22種，起源于33 Ma左右，但在各國植物志和地方志的記載總和遠超此數(shù)字，其屬下物種數(shù)目是亟待修訂的。短柄草屬植物起源于古地中海區(qū)域，但是具體的起源時間和地點有待深入考證，其在全球的分布成因也待進一步研究。短柄草屬植物在我國西南地區(qū)廣泛分布，也分布在瀾滄江—怒江(湄公河—薩爾溫江分水嶺Mekong-Salween Divide)分水嶺的兩側(cè)，其種群結(jié)構(gòu)需要進一步的深入研究。