馮 平，李云章，孫豐廷，屈 雷，閆海龍

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；3武漢中拓康明生物科技有限公司，湖北 武漢 430040)

羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)又稱(chēng)為接觸傳染性膿皰皮炎病毒(Contagious pustular dermatitis virus，CPDV)，是人畜共患、接觸性、嗜上皮性傳染病羊口瘡的病原[1]。ORFV屬于痘病毒科脊索動(dòng)物痘病毒亞科的副痘病毒屬，病毒粒子呈橢圓形，大小約260 nm×160 nm，外面包繞著螺旋絲狀結(jié)構(gòu)，病毒粒子外常有囊膜包裹[2]。ORFV基因組龐大，約有135個(gè)基因Orf001-Orf135，其中Orf001-Orf008及Orf112-Orf135為末端反向重復(fù)序列區(qū)域，Orf009-Orf111為中央?yún)^(qū)基因組區(qū)域[3-4]。這些基因片段編碼多種不同的蛋白,主要有抗細(xì)胞凋亡蛋白、羊口瘡病毒干擾素抗性蛋白(Interferon resistance protein,IFNR)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、GM-CSF/IL-2(The inhibitor of granulocyte-macrophage colony stimulation factor/interleukin-2，GIF)、CEV-IL-10(A cytokine interleukin-10 orthologue,vIL-10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、dUTPase 蛋白、 錨蛋白(ANK)重復(fù)蛋白、 趨化因子結(jié)合蛋白(Chemokine-binding protein，CBP)、42 ku 蛋白、39 ku 蛋白、10 ku 蛋白、DNA 聚合酶以及 RNA 聚合酶等[5-9]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ORFV的研究主要集中在與病毒毒力、免疫調(diào)節(jié)以及免疫原性相關(guān)的蛋白方面，如與病毒毒力和免疫逃避有關(guān)的 IL-10和VEGF 等，與宿主免疫防御機(jī)制和免疫逃避有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)蛋白OV_IFNR、GIF、vIL-10和VEGF等，以及能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)且具有免疫原性的39和42 ku蛋白等[10-13]。

ORFV免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，但體液免疫反應(yīng)也發(fā)揮著一定的作用[14-15]。42 ku蛋白由Orf011(B2L)基因編碼，又稱(chēng)為B2L蛋白，是病毒表面囊膜的組成成分之一，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)還可引起淋巴細(xì)胞的增殖分化[16]，被廣泛應(yīng)用于副痘病毒屬的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[17-18]。

39 ku蛋白又稱(chēng)為F1L蛋白，由Orf059(F1L)基因編碼，F(xiàn)1L基因長(zhǎng)1 005 bp，位于ORFV基因組比較保守的中部區(qū)域[19]。有研究證實(shí)，利用純化的不同ORFV毒株分別制備單克隆抗體，然后通過(guò)免疫熒光技術(shù)成功檢測(cè)到3種單克隆抗體均與病毒顆粒表面的囊膜特異性結(jié)合，而F1L蛋白和22 ku蛋白則是ORFV單克隆抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)。蛋白免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用ORFV制備的兔抗羊口瘡病毒多克隆血清，也能檢測(cè)到F1L蛋白和22 ku蛋白條帶，這表明F1L蛋白為免疫原性蛋白[20]。同時(shí)還有研究表明，宿主體液免疫產(chǎn)生的抗體主要與F1L蛋白結(jié)合，該蛋白是病毒表面微管的組成成分之一，能夠刺激宿主產(chǎn)生中和抗體，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)F1L蛋白是免疫原性蛋白[21]。此外，該蛋白能夠與表達(dá)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素(HS)受體結(jié)合，在病毒吸附和侵入過(guò)程中起重要作用[12]。鑒于此蛋白的重要性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其高度關(guān)注，以期將其應(yīng)用于基因工程疫苗的研制及疾病的診斷等方面。

目前，疫苗接種被認(rèn)為是預(yù)防和控制該病可靠且有效的手段。國(guó)外已有羊口瘡弱毒疫苗，但我國(guó)市場(chǎng)上尚無(wú)口瘡弱毒疫苗供應(yīng)。由于弱毒疫苗本身存在毒力返強(qiáng)、病毒擴(kuò)散等缺陷。因此，研制使用簡(jiǎn)單、方便、免疫效果確實(shí)的羊口瘡基因工程亞單位疫苗已成為防控羊口瘡疫病的必然趨勢(shì)。目前，ORFV的2種主要抗原基因B2L和F1L已經(jīng)在不同的系統(tǒng)中獲得了單獨(dú)或共同表達(dá)，如原核系統(tǒng)和真核表達(dá)載體pCDNA3.1、pVAX1等[22-25]。此外，國(guó)內(nèi)已經(jīng)研發(fā)出B2L基因的重組菌，該重組菌可以傳代且高效表達(dá)B2L蛋白[26]。然而，原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白缺乏相關(guān)的翻譯后修飾，而目的蛋白在pCDNA3.1、pVAX1質(zhì)粒中的表達(dá)具有水平低、費(fèi)用高、操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

本課題組從陜西榆林發(fā)病的陜北白絨山羊病料中分離出ORFV-Yulin株，并在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)其B2L全長(zhǎng)基因進(jìn)行了表達(dá)[27]，本研究擬進(jìn)一步對(duì)ORFV-Yulin株的F1L全長(zhǎng)基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，并采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)B2L和F1L進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，以期為羊口瘡基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體、菌株與主要試劑 MDBK細(xì)胞、昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒pBac5、線性化的 Bacmid、陜北白絨山羊ORFV榆林株ORFV-YulinB2L基因T載體(pGT-B2L)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、預(yù)染蛋白Marker(CW0986M)、SDS-PAGE上樣緩沖液(CW0027A)，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR 反應(yīng)試劑、pGEM-Teasy載體、PrimeSTAR?HS高保真聚合酶、總DNA提取試劑盒、DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MGA公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Sofast，11103)，購(gòu)自梭華公司；抗His-Tag Mouse(KM8001)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(LK2003)，購(gòu)自天津三箭生物科技有限公司;昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基SFX-Insect(SH30278.02)，購(gòu)自HyClone。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中登錄的ORFVF1L基因序列(GenBank登錄號(hào)KU199840.1)設(shè)計(jì)引物1F/1R，用于擴(kuò)增F1L基因。根據(jù)B2L[27]和F1L的測(cè)序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)串聯(lián)的桿狀病毒表達(dá)引物2F/2R和3F/3R，引物均由中美泰和公司合成，其序列見(jiàn)表1。

表1 本研究中所用到的引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in this study

注：2F和3R序列中的下劃線部分分別是NheⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。

Note: The underlined in sequences of 2F and 3R represent the cleavage sitesNheⅠ andHindⅢ,respectively.

1.2 F1L全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增

用總DNA提取試劑盒從ORFV-Yulin株轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取ORFV的DNA，以之為模板，用表1中的克隆引物1F/1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，引物1F和1R(25 pmol/μL)各1 μL，DNA模板4 μL，PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增條件為:98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3 F1L全長(zhǎng)基因的遺傳變異分析

用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將其與pGEM-Teasy載體連接后，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定(PCR反應(yīng)程序同上)，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒送中美泰和公司測(cè)序，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGT-F1L。從GenBank中選取其他15株ORFV毒株(表2)的F1L基因序列，利用DNAStar分析本試驗(yàn)分離毒株與這15株參考毒株核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

1.4 融合基因rB2LcF1L的PCR擴(kuò)增與pGT-rB2LcF1L的構(gòu)建

分別以pGT-B2L和1.3中獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒pGT-F1L為模板，用表1中的表達(dá)載體引物2F/2R和3F/3R,分別擴(kuò)增B2L融合基因(rB2L)和F1L去掉編碼1-70位氨基酸信號(hào)肽的核苷酸融合基因(cF1L)，反應(yīng)體系和程序同上。rB2L和cF1L融合基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收純化，送中美泰和公司測(cè)序后進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增。

表2 本研究中用到的其他ORFV毒株信息Table 2 Information of ORFV strains used in this study

利用堿基linker連接，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增獲得ORFV rB2L-linker-cF1L融合基因(rB2LcF1L)。融合PCR擴(kuò)增體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus) 10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，rB2L和cF1L融合PCR模板各4 μL，PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s ，10個(gè)循環(huán)。然后取1 μL前述 PCR產(chǎn)物作為第2次PCR的模板，以2F和3R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，模板1 μL，引物2F、3R(25 pmol/μL)各1 μL， PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

切膠回收rB2LcF1L基因，將其與pGEM-Teasy載體連接后，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同第2次PCR)，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送中美泰和公司測(cè)序，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGT-rB2LcF1L。

1.5 rB2LcF1L在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

1.5.1 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體pBac-rB2LcF1L的構(gòu)建 將pGT-rB2LcF1L和桿狀病毒表達(dá)載體pBac5分別用NheⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，均轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4節(jié)第2次PCR擴(kuò)增)，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和公司測(cè)序。將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pBac-rB2LcF1L。

1.5.2 昆蟲(chóng)桿狀病毒的包裝 取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以1×106mL-1的細(xì)胞密度接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sf9細(xì)胞，置于27 ℃培養(yǎng)2 h，待細(xì)胞的融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基將3 μg pBac-rB2LcF1L與3 μg線性化的 Bacmid混勻，作為溶液Ⅰ；用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5 μL的梭華轉(zhuǎn)染試劑后，緩慢滴加到溶液Ⅰ中，混勻，靜置20 min。將混合液加入到上述接種了sf9的細(xì)胞板中，27 ℃孵育5～7 d，熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因cGFP的表達(dá)情況，待病變細(xì)胞達(dá)到90%以上后收獲細(xì)胞上清液于1 mL離心管中，標(biāo)注為P1代重組桿狀病毒，-80 ℃長(zhǎng)期保存。

1.5.3 B2L和F1L重組蛋白在sf9細(xì)胞中的表達(dá)與驗(yàn)證 將sf9細(xì)胞按照2.5×106mL-1的細(xì)胞總數(shù)鋪入T25方瓶，待細(xì)胞貼壁2 h后，用1 mL注射器將100 μL P1代病毒盲接到T25方瓶中，培養(yǎng)5～7 d，觀察熒光，收取細(xì)胞上清液和細(xì)胞樣品備用。向細(xì)胞樣品中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5～10 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液。對(duì)細(xì)胞上清液和細(xì)胞處理后的樣品，用12%的SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。切取凝膠上的目的蛋白條帶，送華大基因公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。與此同時(shí)，將上述樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別以His標(biāo)簽抗體為一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行孵育，用ECL顯色液進(jìn)行顯色，最后在化學(xué)發(fā)光儀中曝光。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1L全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增及序列分析

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度為1 029 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。序列分析結(jié)果顯示，ORFV-Yulin株的F1L高度保守，與表2中15株參比毒株核苷酸的相似性為96.7%～99.0%，氨基酸的相似性為96.1%～99.4%，其中與ORFV FJ-MH2015株F1L序列核苷酸和氨基酸的相似性最高，分別為99.0%和99.4%。F1L基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果(圖2)顯示，該毒株與參考毒株XP(KM675408.1)、FJ-MH2015(KU199840.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株處于同一進(jìn)化分支上。

M．DL5000 DNA Marker；1.F1L基因全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物M．DL5000 DNA Marker；1.Amplification product of full-length F1L gene圖1 ORFV-Yulin株F1L基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of F1L of ORFV-Yulin

圖2 ORFV-Yulin株F1L基因的遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree according to F1L gene of ORFV-Yulin

2.2 rB2LcF1L融合基因的擴(kuò)增

2.2.1 cF1L融合基因的擴(kuò)增 由圖3可知，cF1L擴(kuò)增獲得了855 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。將純化后的PCR產(chǎn)物送中美泰和公司測(cè)序，結(jié)果正確。

2.2.2 rB2L融合基因的擴(kuò)增 圖4顯示，rB2L擴(kuò)增獲得了1 180 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。將純化后的PCR產(chǎn)物送中美泰和公司測(cè)序，結(jié)果正確。

M．DL5000 DNA Marker；1.cF1L基因擴(kuò)增產(chǎn)物M．DL5000 DNA Marker；1.Amplification product of cF1L gene

2.2.3 rB2LcF1L融合基因的擴(kuò)增 利用2.2.1和2.2.2中獲得的PCR模板進(jìn)行融合PCR，獲得目的片段(1 983 bp)后與pGEM-Teasy載體連接，獲得載體pGT-rB2LcF1L。對(duì)pGT-rB2LcF1L進(jìn)行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果獲得了3 000和1 983 bp的片段(圖5)，與預(yù)期結(jié)果相符。將該質(zhì)粒送美泰和公司測(cè)序，結(jié)果正確。

M．DL5000 DNA Marker；1.質(zhì)粒pGT-rB2LcF1LM．DL5000 DNA Marker；1.The plasmid pGT-rB2LcF1L圖5 pGT-rB2LcF1L的NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.5 Double digestion of pGT-rB2LcF1L with NheⅠ and HindⅢ

2.3 pBac-rB2LcF1L載體的鑒定

菌落PCR鑒定獲得了1 983 bp的片段(圖略)，與預(yù)期結(jié)果一致。pBac-rB2LcF1L載體經(jīng)NheⅠ和HindⅢ雙酶切后獲得了6 640和1 983 bp的片段(圖6)，其長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符，質(zhì)粒pBac-rB2LcF1L測(cè)序鑒定結(jié)果正確，表明pBac-rB2LcF1L載體構(gòu)建成功。

M．DL5000 DNA Marker；1.質(zhì)粒pBac-rB2LcF1LM．DL5000 DNA Marker；1.The plasmid named pBac-rB2LcF1L圖6 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)重組質(zhì)粒pBac-rB2LcF1L的NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.6 Double digestion of recombinant baculovirus expression vector pBac-rB2LcF1L with NheⅠ and HindⅢ

2.4 rB2LcF1L融合蛋白在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

2.4.1 表達(dá)rB2LcF1L的昆蟲(chóng)桿狀病毒的包裝 將質(zhì)粒pBac-rB2LcF1L轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，27 ℃孵育5 d后即可觀察到報(bào)告基因cGFP的表達(dá)，細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光(圖7)，表明桿狀病毒包裝成功，獲得了表達(dá)rB2LcF1L融合蛋白的桿狀病毒。

圖7 表達(dá)融合蛋白rB2LcF1L的昆蟲(chóng)桿狀病毒cGFP基因的表達(dá)(×200)Fig.7 Expression of cGFP in baculovirus expressing the rB2LcF1L protein of ORFV-Yulin (×200)

2.4.2 rB2LcF1L在sf9細(xì)胞中的表達(dá) SDS-PAGE結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞樣品中均有1條明顯的條帶，分子質(zhì)量約為80 ku(圖8)，表明融合蛋白rB2LcF1L在sf9細(xì)胞中得到了表達(dá)，且表達(dá)的蛋白有一部分可分泌到細(xì)胞外。

M.蛋白Marker；1.細(xì)胞上清；2.細(xì)胞沉淀M．Protein Marker;1.Cell supernatant；2.Cell precipitation圖8 ORFV-Yulin 株rB2LcF1L在sf9細(xì)胞中的表達(dá)Fig.8 Expression of rB2LcF1L of ORFV-Yulin in sf9 cells

Western blotting結(jié)果(圖9)和后續(xù)的譜鑒定結(jié)果均證實(shí),B2LcF1L表達(dá)成功。

M.蛋白Marker；1.細(xì)胞上清；2.細(xì)胞沉淀M．Protein Marker;1.Cell supernatant；2.Cell precipitation圖9 ORFV-Yulin株rB2LcF1L在sf9細(xì)胞中表達(dá)的Western blotting鑒定Fig.9 Western blotting of rB2LcF1L of ORFV-Yulin in sf9 cells

3 討 論

李雯麗[28]對(duì)陜西省4個(gè)區(qū)/縣的白絨山羊和奶山羊主要養(yǎng)殖基地進(jìn)行了口瘡病原的檢測(cè)和發(fā)病率調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn),檢出率最高的達(dá)82.6%，最低的也達(dá)到了24.1%，而且檢出率最高羊場(chǎng)發(fā)生過(guò)相當(dāng)嚴(yán)重的羊口瘡疫情，導(dǎo)致大批量新生羔羊被淘汰，這說(shuō)明陜西山羊口瘡病毒攜帶率和發(fā)病情況不容樂(lè)觀。本研究以本課題組前期從榆林市某白絨山羊場(chǎng)分離到的ORFV-Yulin株為研究對(duì)象，對(duì)其F1L的全長(zhǎng)基因進(jìn)行了克隆分析，發(fā)現(xiàn)ORFV-Yulin株的F1L與參考毒株FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)及XP(KM675408.1)F1L基因的相似度均高達(dá)99.0%，這表明羊口瘡病毒的F1L基因高度保守。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析表明，ORFV-Yulin株與FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)以及XP(KM675408.1)株同屬于一個(gè)分支，而FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)以及XP(KM675408.1)等毒株的宿主均為山羊。綜上所述，本課題組從白絨山羊疑似病例分離到的毒株可能與近年來(lái)山羊的頻繁流動(dòng)，既跨地區(qū)引種等因素有關(guān)。對(duì)F1L基因進(jìn)行克隆和序列分析，有利于從分子水平上了解ORFV-Yulin株病毒，并且對(duì)白絨山羊種群中ORFV的流行病學(xué)調(diào)查、分子生物學(xué)研究及工程苗的研制和開(kāi)發(fā)等具有重要意義。

由于ORFV具有免疫逃避機(jī)制，因此在動(dòng)物感染該病毒后，機(jī)體無(wú)法獲得終身免疫力，而且容易引起繼發(fā)性感染。此外，由于羔羊免疫機(jī)制還未健全，因此尚不能通過(guò)注射疫苗的方式提高新生羔羊抵抗ORFV感染的能力，而母源特異性抗體的保護(hù)時(shí)間又較短，若ORF一旦流行，羔羊淘汰率勢(shì)必增加?，F(xiàn)在國(guó)外臨床生產(chǎn)中應(yīng)用的羊口瘡疫苗多為弱毒苗，而羊口瘡弱毒苗在生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中會(huì)面臨病毒擴(kuò)散、毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。為此，安全性能高、免疫原性強(qiáng)、不存在宿主致病風(fēng)險(xiǎn)的羊口瘡基因工程亞單位疫苗的研制就顯得極為迫切。已有研究表明，F(xiàn)1L具有肝素結(jié)合活性，使該蛋白在細(xì)胞的吸附和侵入過(guò)程中可能起重要的作用[21]。與之相一致，Gallina等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1L重組蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生功效高效的中和抗體，可能通過(guò)阻止ORFV對(duì)宿主細(xì)胞的吸附而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。而作為ORFV囊膜的重要組分，B2L蛋白夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的IgG，王延璞等[26]將B2L基因與pGEM-4Z載體重組，獲得了具有較高表達(dá)水平且能夠傳代的重組菌，這為ORFV亞單位疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。鑒于F1L和B2L蛋白的重要性，趙魁[7]構(gòu)建了F1L和B2L基因單獨(dú)表達(dá)以及串聯(lián)表達(dá)的核酸疫苗，免疫效果優(yōu)于單獨(dú)F1L或B2L基因核酸疫苗，這說(shuō)明F1L和B2L基因串聯(lián)表達(dá)的重組蛋白的免疫效果應(yīng)該更好。本試驗(yàn)將去掉信號(hào)肽區(qū)域的F1L和B2L基因串聯(lián)，并在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了部分分泌型的F1L和B2L串聯(lián)重組蛋白，為以后ORFV基因工程亞單位疫苗的批量生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。