寧 越，吳 森，張 樂，昝林森,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

秦川牛是我國著名的地方黃牛品種，具有耐粗飼、抗逆性(病)強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)的特點(diǎn)，但生長慢、產(chǎn)肉量低且脂肪沉積欠佳[1]。我國地方黃牛資源豐富，西北農(nóng)林科技大學(xué)牛業(yè)團(tuán)隊(duì)一直致力于秦川牛肉用性狀選育工作，利用常規(guī)育種手段及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，歷經(jīng)20余年，已成功選育出秦川牛肉用新品系，其生長速度、產(chǎn)肉性能均較秦川牛有顯著提高。

IRX3基因是Iroquois同源盒基因家族的成員之一，具有較高的保守性，是調(diào)節(jié)脊索動(dòng)物脂肪沉積的重要基因[2-3]。該家族的各成員在脊椎動(dòng)物胚胎形成過程中參與許多調(diào)控作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，IRX3是調(diào)控脂肪組織的重要因子，并對(duì)脂肪沉積有重要影響[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，敲除斑馬魚IRX3a基因后，胰腺饑餓素ε細(xì)胞(pancreatic ghrelin-producing epsilon cells)數(shù)量上升，胰島素β細(xì)胞數(shù)量下降(insulin-producing beta-cells)，胰高血糖素α細(xì)胞(glucagon-producing alpha-cells)數(shù)量上升，表明胰腺中IRX3基因的功能與肥胖和Ⅱ型糖尿病有直接關(guān)聯(lián)[6-9]。另外，人們?cè)瓉硪恢闭J(rèn)為人類肥胖在遺傳上主要是由于FTO基因突變導(dǎo)致的，但實(shí)際上是由FTO基因內(nèi)部的一些肥胖相關(guān)元件與位于基因組上較遠(yuǎn)位置的IRX3基因發(fā)生互作而導(dǎo)致的，因此IRX3很可能是一個(gè)具有肥胖功能的基因[10-12]。而FTO基因自身似乎只對(duì)肥胖產(chǎn)生周邊效應(yīng)[13-15]。

目前，有關(guān)IRX3基因的研究仍然較少，在非模式動(dòng)物上的研究幾乎沒有。因此，本研究利用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)，檢測(cè)IRX3基因在秦川牛不同月齡不同組織中的表達(dá)情況，以揭示IRX3在秦川牛機(jī)體中的表達(dá)規(guī)律，為秦川牛的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試組織與器官 供試材料包括3頭秦川牛胎牛(妊娠3個(gè)月的胎兒)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、肌肉(背最長肌)，3頭6月齡秦川牛的心臟、肝臟、肺臟、大腸、小腸、肌肉(背最長肌)，3頭24月齡秦川牛的心臟、肝臟、肺臟、大腸、肌肉(背最長肌)，以及6月齡、18月齡、24月齡、60月齡秦川牛的脂肪組織，所有組織器官均由西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心種質(zhì)資源庫于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑和總RNA提取試劑盒，TIANGEN?公司產(chǎn)品；天凈沙RNase清除劑A型，北京天恩澤?公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Primix ExTaqTMⅡ試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；7500 Real Time PCR儀，ABI公司產(chǎn)品。

1.2 牛組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

用Trizol法提取牛組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法和分光光度計(jì)檢測(cè)法對(duì)所提RNA的品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。將品質(zhì)符合要求的組織總RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反應(yīng)得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 IRX3表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 選用GAPDH、β-actin、B2M、Ubiquitin和18S rRNA 為內(nèi)參基因，檢測(cè)其在各待測(cè)組織中的表達(dá)情況，利用NormFinder和geNorm進(jìn)行分析，通過計(jì)算穩(wěn)定值來確定最適內(nèi)參數(shù)量及最佳內(nèi)參，結(jié)果顯示GAPDH為最佳內(nèi)參基因，因此選用GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)秦川牛IRX3的mRNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量特異性引物，交由TaKaRa?公司合成；GAPDH引物由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物相關(guān)信息見表1。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù) 用SYBR?Primix ExTaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR?Primix ExTaqⅡ10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板 2 μL，dH2O 6 μL。反應(yīng)在7500 Real Time PCR儀(ABI公司產(chǎn)品)上進(jìn)行，具體循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次。熔解曲線程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

表1 IRX3和GAPDH的qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR of IRX3 and GAPDH

1.4 數(shù)據(jù)處理

用待測(cè)基因的Ct值減去對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因GAPDH的Ct值,即可得到每種組織的ΔCt值，在待測(cè)組織中選擇一種組織作為參照(其表達(dá)量設(shè)定為1)，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)并分析相對(duì)表達(dá)量[16-17]，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

相對(duì)表達(dá)量用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛胎牛IRX3基因的組織表達(dá)規(guī)律

以IRX3基因在肝臟中的表達(dá)量為參照，其在秦川牛胎牛8個(gè)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量見圖1。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示組織間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示組織間差異極顯著(P<0.01)。圖2,3同Different lowercase letters mean significant difference among tissues at P<0.05,different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01.The same for Fig.2 and Fig.3圖1 秦川牛胎牛IRX3基因的組織表達(dá)規(guī)律Fig.1 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of Qinchuan fetal bovine

由圖1可知，在所檢測(cè)的組織中，肺臟IRX3基因的表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是腎臟，其IRX3基因的表達(dá)量極顯著高于除肺臟外的其他組織(P<0.01)；再次是心臟，其IRX3基因的表達(dá)量顯著高于除肺臟、腎臟外的其他組織(P<0.05)；肝臟、脾臟、大腸、小腸和肌肉等組織中IRX3基因表達(dá)量極低。表明IRX3基因在秦川牛胎牛時(shí)期與肺臟和腎臟發(fā)育緊密相關(guān)。

2.2 6月齡秦川牛IRX3基因的組織表達(dá)規(guī)律

以IRX3基因在大腸中的表達(dá)量為參照，其在6月齡秦川牛6個(gè)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。由圖2可知，在所檢測(cè)的組織中，肺臟IRX3基因的表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是心臟，IRX3基因表達(dá)量顯著高于除肺臟外的其他組織(P<0.05)；肝臟、大腸、小腸和肌肉中IRX3表達(dá)量很低。表明IRX3基因在秦川牛6月齡時(shí)對(duì)肺臟和心臟的發(fā)育有一定影響。

2.3 24月齡秦川牛IRX3基因的組織表達(dá)規(guī)律

以IRX3基因在肌肉中的表達(dá)量為參照，其在24月齡秦川牛5個(gè)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量見圖3。由圖3可知，在所檢測(cè)的組織中，肺臟中IRX3基因表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次是心臟和肝臟，其IRX3基因表達(dá)量均處于較高水平；大腸和肌肉中IRX3基因表達(dá)量很低。

圖2 秦川牛6月齡犢牛IRX3基因的組織表達(dá)規(guī)律Fig.2 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of 6-month Qinchuan cattle

2.4 不同年齡秦川牛IRX3基因在相同組織中的表達(dá)規(guī)律

以IRX3基因在胎牛時(shí)期各組織中的表達(dá)量為參照，其在秦川牛不同發(fā)育階段同一組織中的相對(duì)表達(dá)量如圖4所示。由圖4可知，在心臟和肝臟組織中，IRX3基因的表達(dá)量隨著年齡的增長而持續(xù)增高，其中以肝臟的增長幅度最大，并且24月齡時(shí)的表達(dá)量極顯著高于胎牛和6月齡時(shí)期(P<0.01)。對(duì)肺臟和大腸而言，IRX3基因在胎牛中的表達(dá)量較高，出生后在肺部的表達(dá)量有所下降但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)，而在大腸中的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；之后隨著年齡的增長，IRX3基因表達(dá)量在24月齡達(dá)到最高，極顯著高于胎牛和6月齡時(shí)期(P<0.01)。各組織中只有肌肉組織IRX3基因在胎牛中的表達(dá)量最高，出生后表達(dá)量隨著生長發(fā)育而極顯著降低(P<0.01)?？梢?，IRX3基因在不同時(shí)期秦川牛同一組織中的表達(dá)量均有顯著差異，推測(cè)其在秦川牛生長發(fā)育中有較為活躍的功能。

同一組織不同年齡階段相比，圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01

2.5 IRX3基因在不同時(shí)期秦川牛脂肪組織中的表達(dá)規(guī)律

以24月齡脂肪組織中IRX3的表達(dá)量為參照，其他年齡段脂肪組織中IRX3基因的表達(dá)情況如圖5所示。由圖5可以看出，隨著年齡的增長，秦川牛脂肪組織中IRX3基因的表達(dá)量呈先升高后降低最后再升高的變化趨勢(shì)，18月齡時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于其他年齡段(P<0.01)；其次是6月齡，IRX3表達(dá)量極顯著高于24～60月齡(P<0.01)。

不同年齡相比，圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01圖5 秦川牛IRX3基因在脂肪組織中的表達(dá)規(guī)律Fig.5 mRNA expression of IRX3 gene in fat tissue of Qinchuan cattle

3 討 論

我國地方黃牛資源豐富，但多為役肉或肉役兼用型，產(chǎn)肉量較低，脂肪沉積欠佳[1]。如何依靠地方品種資源和生物技術(shù)手段加快黃牛遺傳改良，積極培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)肉牛品種，是我國肉牛產(chǎn)業(yè)和廣大科技工作者面臨的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，IRX3基因在調(diào)節(jié)脊索動(dòng)物生長發(fā)育、脂肪沉積等方面有重要作用[2-3]。因此，研究IRX3基因在秦川牛組織中的表達(dá)情況，對(duì)利用現(xiàn)代分子育種方法進(jìn)行肉脂品質(zhì)改良有重要的指導(dǎo)意義。

IRX3基因作為Iroquois同源盒基因家族的成員之一，具有較高的保守性。該家族的各成員在脊椎動(dòng)物胚胎的形成模式中參與許多調(diào)控作用[4]。Dankel等[18]對(duì)通過外科手術(shù)去脂(腹部脂肪)的肥胖患者術(shù)前和1年后及正常偏瘦人的相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后IRX3、IRX5等基因顯著上調(diào)，從而發(fā)現(xiàn)IRX3是調(diào)控脂肪組織的重要因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，在秦川牛胎牛、6月齡、24月齡時(shí)，IRX3基因在肺臟組織中的表達(dá)量始終最高，并在成年牛時(shí)期達(dá)到最高；心臟組織的IRX3表達(dá)量也處于較高水平，并隨牛生長發(fā)育階段的推進(jìn)而增大，因此推測(cè)該基因與心臟的發(fā)育有著密切聯(lián)系，這點(diǎn)與已有的研究結(jié)果即IRX3可以影響心臟功能相一致[19-23]。IRX3基因在秦川牛肝臟、脾臟、大腸、小腸和肌肉中的表達(dá)量都處于較低水平。

在脂肪組織中，IRX3基因的表達(dá)情況與生長發(fā)育情況一致，在6到18月秦川牛快速生長時(shí)期極顯著高于其他時(shí)期，并且表達(dá)量隨年齡增加而增長；而在18～24月齡秦川牛生長變得緩慢，IRX3基因表達(dá)量也顯著降低。分析發(fā)現(xiàn)，IRX3基因在脂肪組織中的表達(dá)量與牛生長速度正相關(guān)，表明IRX3基因在秦川牛發(fā)育過程中與脂肪沉積有密切聯(lián)系。